L'autophagie est un processus de dégradation des constituants cellulaires cytoplasmiques, qui sert de mécanisme de survie dans les cellules affamées, et elle est caractérisée par la séquestration du cytoplasme en vrac et des organites dans les vésicules à double membrane appelées autophagosomes. L'autophagie a été liée à divers processus pathologiques tels que les maladies neurodégénératives et la tumorigenèse, ce qui souligne son importance biologique et médicale. Nous avons précédemment caractérisé le gène de la protéine membranaire vacuole 1 (VMP1), qui est fortement activé dans la pancréatite aiguë, une maladie associée à des changements morphologiques ressemblant à l'autophagie. Nous montrons ici que l'expression de VMP1 déclenche l'autophagie dans les cellules de mammifères. L'expression de VMP1 induit la formation de caractéristiques ultrastructurales de l'autophagie et le recrutement de la chaîne légère 3 de la protéine 1 associée aux microtubules (LC3), qui est inhibée après traitement avec l'inhibiteur de l'autophagie 3-méthiladénine. La VMP1 est induite par la famine et les traitements à la rapamycine. Son expression est nécessaire pour l'autophagie, car le petit ARN interférent VMP1 inhibe la formation d'autophagosomes sous les deux stimuli autophagiques. VMP1 est une protéine transmembranaire qui co-localise avec LC3, un marqueur des autophagosomes. Il interagit avec Beclin 1, un initiateur de l'autophagie chez les mammifères, par le biais du domaine VMP1-Atg, qui est essentiel à la formation des autophagosomes. L'expression endogène de VMP1 co-localise avec LC3 dans le tissu pancréatique subissant une autophagie induite par une pancréatite. Enfin, l'expression stable de VMP1 ciblée sur les cellules acineuses du pancréas chez les souris transgéniques induit la formation d'autophagosomes. Nos résultats identifient VMP1 comme une nouvelle protéine membranaire liée à l'autophagie impliquée dans les étapes initiales du processus autophagique des cellules de mammifères. L'autophagie est un processus de dégradation des constituants cellulaires cytoplasmiques, qui sert de mécanisme de survie dans les cellules affamées, et elle est caractérisée par la séquestration du cytoplasme en vrac et des organites dans les vésicules à double membrane appelées autophagosomes. L'autophagie a été liée à divers processus pathologiques tels que les maladies neurodégénératives et la tumorigenèse, ce qui souligne son importance biologique et médicale. Nous avons précédemment caractérisé le gène de la protéine membranaire vacuole 1 (VMP1), qui est fortement activé dans la pancréatite aiguë, une maladie associée à des changements morphologiques ressemblant à l'autophagie. Nous montrons ici que l'expression de VMP1 déclenche l'autophagie dans les cellules de mammifères. L'expression de VMP1 induit la formation de caractéristiques ultrastructurales de l'autophagie et le recrutement de la chaîne légère 3 de la protéine 1 associée aux microtubules (LC3), qui est inhibée après traitement avec l'inhibiteur de l'autophagie 3-méthiladénine. La VMP1 est induite par la famine et les traitements à la rapamycine. Son expression est nécessaire pour l'autophagie, car le petit ARN interférent VMP1 inhibe la formation d'autophagosomes sous les deux stimuli autophagiques. VMP1 est une protéine transmembranaire qui co-localise avec LC3, un marqueur des autophagosomes. Il interagit avec Beclin 1, un initiateur de l'autophagie chez les mammifères, par le biais du domaine VMP1-Atg, qui est essentiel à la formation des autophagosomes. L'expression endogène de VMP1 co-localise avec LC3 dans le tissu pancréatique subissant une autophagie induite par une pancréatite. Enfin, l'expression stable de VMP1 ciblée sur les cellules acineuses du pancréas chez les souris transgéniques induit la formation d'autophagosomes. Nos résultats identifient VMP1 comme une nouvelle protéine membranaire liée à l'autophagie impliquée dans les étapes initiales du processus autophagique des cellules de mammifères. L'autophagie est un processus de dégradation des constituants cellulaires cytoplasmiques conservé de manière évolutive, qui sert de mécanisme de survie dans les cellules affamées (1Codogno P. Meijer A.J. Cell Death Differ. 2005 ; 12: 1509-1518Crossref PubMed Scopus (946) Google Scholar, 2Kroemer G. Jäättelä M. Nat. Rev. Cancer. 2005 ; 5: 886-897Crossref PubMed Scopus (1037) Google Scholar, 3Levine B. Klionsky D.J. Dev. Cell. 2004 ; 6: 463-477Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3189) Google Scholar). Ce processus catabolique est impliqué dans le renouvellement des protéines à longue durée de vie et d'autres macromolécules cellulaires, et il pourrait jouer un rôle protecteur dans le développement, le vieillissement, la mort cellulaire et la défense contre les agents pathogènes intracellulaires (4Hara T. Nakamura K. Matsui M. Yamamoto A. Nakahara Y. Suzuki-Migishima R. Yokoyama M. Mishima K. Saito I. Okano H. Mizushima N. Nature. 2006 ; 441: 885-889Crossref PubMed Scopus (3108) Google Scholar, 5Komatsu M. Ueno T. Waguri S. Uchiyama Y. Kominami E. Tanaka K. Cell Death Differ. 2007 ; 14: 887-894Crossref PubMed Scopus (136) Google Scholar, 6Levine B. Cell. 2005 ; 120: 159-162Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (690) Google Scholar, 7Lum J.J. Bauer D.E. Kong M. Harris M.H. Li C. Lindsten T. Thompson C.B. Cell. 2005 ; 120: 237-248Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1263) Google Scholar, 8Qu X. Zou Z. Sun Q. Luby-Phelps K. Cheng P. Hogan R. Gilpin C. Levine B. Cell. 2007 ; 128: 931-946Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (523) Google Scholar). Par des études morphologiques, l'autophagie a été liée à divers processus pathologiques tels que les maladies neurodégénératives et la tumorigenèse, ce qui souligne son importance biologique et médicale (4Hara T. Nakamura K. Matsui M. Yamamoto A. Nakahara Y. Suzuki-Migishima R. Yokoyama M. Mishima K. Saito I. Okano H. Mizushima N. Nature. 2006 ; 441: 885-889Crossref PubMed Scopus (3108) Google Scholar, 9Pattingre S. Levine B. Cancer Res. 2006 ; 66: 2885-2888Crossref PubMed Scopus (252) Google Scholar, 10Shintani T. Klionsky D.J. Science. 2004 ; 306: 990-995Crossref PubMed Scopus (2163) Google Scholar). Les premiers rapports d'autophagie dans les maladies humaines comprennent les caractéristiques autophagiques ultrastructurales décrites dans le pancréas de la pancréatite humaine (11Helin H. Mero M. Markkula H. Helin M. Virchows Arch. A Pathol. Anat. Histol. 1980 ; 387: 259-270Crossref PubMed Scopus (63) Google Scholar, 12Willemer S. Klöppel G. Kern H.F. Adler G. Virchows Arch. A Pathol. Anat. Histopathol. 1989 ; 415: 115-123Crossref PubMed Scopus (46) Google Scholar). L'autophagie est caractérisée par la séquestration du cytoplasme en vrac et des organites dans des vésicules à double membrane appelées autophagosomes, qui acquièrent éventuellement des caractéristiques de type lysosomal (13Mizushima N. Cell Death Differ. 2005 ; 12: 1535-1541Crossref PubMed Scopus (404) Google Scholar, 14Klionsky D.L. Emr sd Science. 2000 ; 290: 1717-1721Crossref PubMed Scopus (2969) Google Scholar). L'autophagie est médiée par un ensemble de produits géniques conservés de manière évolutive (appelés protéines Atg) découverts à l'origine dans la levure (15Klionsky D.J. Cregg J.M. Dunn Jr., W.A. Emr s.d. Sakai Y. Sandoval I.V. Sibirny A. Subramani S. Thumm M. Veenhuis M. Ohsumi Y. Dev. Cell. 2003 ; 5: 539-545Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1016) Google Scholar). Dans les cellules de mammifères, Beclin 1 (3Levine B. Klionsky D.J. Dev. Cell. 2004 ; 6: 463-477Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (3189) Google Scholar, 16Liang X.H. Jackson S. Seaman M. Brown K. Kempkes B. Hibshoosh H. Levine B. Nature. 1999 ; 402: 672-676Crossref PubMed Scopus (2737) Google Scholar, 17Liang C. Feng P. Ku B. Dotan I. Canaani D. Oh B.H. Jung J.U. Nat. Cell Biol. 2006 ; 8: 688-699Crossref PubMed Scopus (841) Google Scholar, 18 Pattingre S. Tassa A. Qu X. Garuti R. Liang X.H. Mizushima N. Packer M. Schneider M.D. Levine B. Cell. 2005 ; 122: 927-939Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (2931) Google Scholar) favorise la formation d'autophagosomes lorsqu'elle fonctionne dans le cadre d'un complexe avec la phosphatidylinositol 3-kinase de classe III (PI3K) 6Les abréviations utilisées sont : PI3Kphosphatidylinositol 3-kinaseVMP1vacuole membrane protein 1LC3light-chain 3siRNAsmall interfering RNA3-MA3-methyladenineGSTglutathione S-transferaseGFPgreen fluorescent proteinmTORmammalian target of rapamycinAtgautophagy-related domainRFPred fluorescent protein. 6Les abréviations utilisées sont :PI3Kphosphatidylinositol 3-kinaseVMP1vacuole membrane protein 1LC3light-chain 3siRNAsmall interfering RNA3-MA3-methyladenineGSTglutathione S-transferaseGFPgreen fluorescent proteinmTORmammalian target of rapamycinAtgautophagy-related domainRFPred fluorescent protein. mediating the localization of other autophagic proteins to the autophagosomal membrane (19Kihara A. Noda T. Ishihara N. Ohsumi Y. J. Cell Biol. 2001 ; 152: 519-530Crossref PubMed Scopus (804) Google Scholar). Cependant, malgré les progrès dans la compréhension de l'autophagie, la formation d'autophagosomes dans les cellules de mammifères est un processus complexe, et ni les mécanismes moléculaires ni tous les gènes impliqués dans sa formation ne sont entièrement élucidés (20Juhasz G. Neufeld T.P. PLoS Biol. 2006 ; 4 : e36Crossref PubMed Scopus (122) Google Scholar, 21Klionsky D.J. J. Cell Sci. 2005 ; 118: 7-18Crossref PubMed Scopus (766) Google Scholar). phosphatidylinositol 3-kinase vacuole membrane protein 1 light-chain 3 small interfering RNA 3-methyladenine glutathione S-transferase green fluorescent protein mammalian target of rapamycin autophagy-related domain red fluorescent protein. phosphatidylinositol 3-kinase vacuole membrane protein 1 light-chain 3 small interfering RNA 3-methyladenine glutathione S-transferase green fluorescent protein mammalian target of rapamycin autophagy-related domain red fluorescent protein. La protéine associée à la pancréatite appelée vacuole membrane protein 1 (VMP1) est une protéine transmembranaire sans homologue connu dans la levure. Nous avons identifié le transcrit VMP1 car il est fortement activé dans les cellules acineuses au début de la pancréatite aiguë expérimentale et son expression transitoire a induit la formation de nombreuses vacuoles cytoplasmiques dans les cellules de mammifères (22Dusetti N.J. Jiang Y. Vaccaro M.I. Tomasini R. Samir Azizi A. Calvo E.L. Ropolo A. Fiedler F. Mallo G.V. Dagorn J.C. Iovanna J.L. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002 ; 290: 641-649Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar). L'expression in situ de l'ARNm de VMP1 était corrélée à la formation de vacuoles dans les cellules acineuses au cours de la pancréatite aiguë expérimentale et au cours de la pancréatite chronique chez les rats WBN/Kob (23Vaccaro M.I. Grasso D. Ropolo A. Iovanna J.L. Cerquetti M.C. Pancreatology. 2003 ; 3: 69-74Crossref PubMed Scopus (34) Google Scholar, 24Jiang P.H. Motoo Y. Vaccaro M.I. Iovanna J.L. Okada G. Sawabu N. Pancreas. 2004 ; 29: 225-230Crossref PubMed Scopus (17) Google Scholar). Dans cette étude, nous avons testé l'hypothèse selon laquelle l'expression de VMP1 est impliquée dans le processus autophagique. Nous montrons que VMP1 est une nouvelle protéine membranaire liée à l'autophagie qui déclenche la formation d'autophagosomes dans les cellules de mammifères. La VMP1 est induite par des stimuli d'autophagie ; elle est nécessaire au développement de l'autophagosome et son expression déclenche l'autophagie, même dans des conditions de saturation en nutriments. VMP1 interagit avec Beclin 1 à travers sa région C-terminale hydrophile, que nous avons nommée domaine Atg car elle est essentielle à la formation des autophagosomes. Nous montrons également que VMP1 co-localise avec la chaîne légère 3 de la protéine 1 associée aux microtubules (LC3) dans les membranes vacuoles du tissu pancréatique subissant une autophagie induite par la pancréatite. Enfin, nous avons constaté que l'expression de VMP1 favorise la formation de vacuoles LC3-positives lorsqu'elle est spécifiquement ciblée sur les cellules acineuses du pancréas chez les souris transgéniques. Lignées cellulaires, transfections et traitements de mammifères - Des lignées cellulaires HeLa, 293T et MCF7 humaines et NIH3T3 (ATCC) de souris ont été utilisées. Les taux de Low-Beclin 1 dans les cellules MCF7 ont été vérifiés par Western blot. Les cellules ont été transfectées à l'aide du réactif FuGENE-6 (Roche Applied Science). Les plasmides étaient pcDNA4-V5-His (Invitrogen) et pEGFP-N1 (Clontech), contenant de l'ADNc VMP1 de rat pleine longueur (NM_138839) (22Dusetti N.J. Jiang Y. Vaccaro M.I. Tomasini R. Samir Azizi A. Calvo E.L. Ropolo A. Fiedler F. Mallo G.V. Dagorn J.C. Iovanna J.L. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002 ; 290: 641-649Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar) ou VMP1ΔAtg sous-cloné au sein des sites de restriction HindIII et BamHI. L'ADNc Beclin 1 humain complet (NM_003766) a été sous-cloné en pECFP-C1 (Clontech) dans l'EcoRI et SalI ou en pcDNA3 (Invitrogen) dans les sites de restriction EcoRI et ApaI. Le pRFP-C1 contenant la LC3 du rat complet a été gentiment fourni par le Dr Maria I. Colombo (Universidad Nacional de Cuyo, Consejo Nacional de Investigaciones Cienti ́ficas y Técnicas (CONICET), Argentine). Les cellules ont également été transfectées en utilisant un transfert médié par l'oligofectamine (Invitrogen) avec un ARNsi pré-conçu pour l'ARNm VMP1 humain en utilisant 5′ -GGCAGAAUAUUGUCCUGUGtt-3 ′, comme sens, et 5′ -CACAGACAAUAUUCUCUGCCtt-3 ′, comme antisens (Ambion ID32935) et 24 h plus tard, les cellules ont été soumises à des stimuli d'autophagie pendant une période supplémentaire de 6 h. Pour l'inhibition de l'autophagie, les cellules ont été traitées avec 10 mm de 3-méthyladénine (3-MA) (Sigma) 2 h avant et pendant la co-transfection avec pcDNA4-VMP1 et pRFP-LC3. L'efficacité du traitement par 3-MA a été vérifiée sur des cellules affamées (données non présentées). Pour l'inhibition de l'hydrolase lysosomale, les cellules ont été traitées avec E64d (10 μg/ml) pendant 4 h avant d'être traitées. L'autophagie a été induite par un milieu dépourvu d'acides aminés/sérum à l'aide de la solution saline équilibrée d'Earle (Invitrogen) ou de traitements à la rapamycine de 55 μm (Calbiochem). La fluorescence a été observée à l'aide d'un microscope à fluorescence Nikon Eclypse 200 (Plan100 ×), d'une microscopie à fluorescence inversée Olympus GX71, d'un microscope confocal Nikon Eclipse C1 (Plan40 ×/0,95 et Plan60 ×/1,40) ou d'un microscope confocal inversé Olympus FV1000 (PLAPO N/1,42). Microscopie électronique à transmission - Les cellules ont été fixées sans être mises en suspension et traitées pour la microscopie électronique à transmission par des procédures standard. Les grilles ont été examinées au microscope électronique Carl Zeiss C-10 (Laboratorio Nacional deInvestigacio ́n y Servicios en Microscopía Electrónica, Université de Buenos Aires). Pourcentage de cellules RFP-LC3 avec coloration ponctuée - Le nombre de cellules avec coloration ponctuée pour 100 cellules transfectées RFP-LC3 fluorescentes a été déterminé dans trois expériences indépendantes. Pour quantifier, le nombre de cellules fluorescentes avec coloration ponctuée a été compté dans six champs aléatoires représentant 100 cellules fluorescentes et exprimé comme la moyenne ± s.d. des résultats combinés. Nous considérons qu'une cellule RFP-LC3 présente une coloration ponctuée lorsque toute la fluorescence rouge est présente comme ponctuée et qu'il ne reste aucune protéine diffusée. Les peptides GST-VMP1 recombinants et les peptides hydrophiles His6-Beclin 1 Protein-VMP1 ont été amplifiés à partir de pcDNA4-VMP1 par PCR et sous-clonés dans pGEX-5X-2 (Amersham Biosciences) pour obtenir des peptides GST-VMP1. Les peptides ont été exprimés dans Escherichia coli BL21 et purifiés par chromatographie d'affinité au glutathion (Amersham Biosciences). L'ADNc de Beclin 1 a été obtenu à partir d'extraits d'ARN total de cellules HeLa et cloné dans pQE31 (Qiagen). His6-Beclin 1 a été exprimé dans E. coli M15 et purifié à l'aide de billes d'acide nickel-nitrilotriacétique-agarose (Qiagen). Isolation de la membrane - Les cellules ont été lavées et homogénéisées avec un homogénéisateur de pilon en téflon motorisé dans un tampon SBE glacé (saccharose 250 mm, EGTA 1 mm, Hepes/KOH 10 mm, pH 7,5) contenant des inhibiteurs de protéase. Les homogénats ont été centrifugés deux fois à 500 × g pendant 15 min. Les surnageants résultants ont été centrifugés à 100 000 × g pendant 1 h. Les pastilles membranaires ont été remises en suspension dans du tampon SBE glacé et traitées avec 1% de Nonidet P-40 (Nonidet P-40), 0,2 m Na2CO3, pH 11,0 ou 1,5 m NaCl. Toutes les étapes ont été effectuées à 4 °C. Les culots membranaires ont été obtenus par centrifugation et les protéines retenues ont été séparées par SDS-PAGE. L'analyse par Western blot a été réalisée en utilisant comme anticorps secondaire un anticorps IgG marqué à la peroxydase fourni avec l'ECL-kit (Amersham Biosciences). L'immunoblotting a été effectué à l'aide du kit ECL et les membranes ont été exposées à un film Kodak BioMax. Essais Pulldown - Les cellules HeLa transfectées avec les plasmides vides pcDNA4-VMP1, pcDNA4-VMP1ΔAtg et pcDNA4 ont été lysées par sonication et solubilisées avec 1% de Triton X-100, suivies d'une centrifugation de 30 min à 100 000 × g. Les surnageants contenant des protéines marquées His ont été incubés avec des billes d'acide nickel-nitrilotriacétique-agarose (Qiagen) pendant 2 h à 4 °C, lavés abondamment avec un tampon contenant 5 mm d'imidazole et élués avec un tampon contenant 120 mm d'imidazole. Les protéines ont été séparées par SDS-PAGE et transférées à la nitrocellulose pour l'immunoblotting. Dans une autre expérience, His6-Beclin 1 produit dans E. coli a été incubé dans des billes d'acide nickel-nitrilotriacétique-agarose avec les peptides GST-VMP1 purifiés. Essais de co-immunoprécipitation - Pour les essais de co-immunoprécipitation, le surnageant de lysats de cellules transfectées par pcDNA4-VMP1 ou traitées à la rapamycine a été incubé avec des antisérums liés à des billes de protéine A-Sepharose™ Cl-4B (Amersham Biosciences) pendant 2 h à 4 °C et lavé abondamment. Les protéines liées ont été éluées avec de la glycine-HCl de 100 mm, pH 2,5, précipitées par de l'acide trichloroacétique à 5%, lavées avec de l'acétone glacée et remises en suspension dans un tampon d'échantillon SDS. Anticorps - Un antisérum polyclonal de lapin contre VMP1 contre le peptide MAQSYAKRIQQRLNSEEKTK (résidus 386-406) a été obtenu et utilisé à la dilution 1:100. Des anticorps polyclonaux de chèvre anti-LC3, de chèvre anti-Beclin 1, de lapin anti-GST, monoclonaux de souris anti-GFP (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), monoclonaux de souris anti-V5 (Invitrogen) ont été utilisés selon le fabricant. Des anticorps anti-lapin et anti-chèvre Alexa Fluor 488 et 590, et anti-souris Alexa Fluor 590 (Molecular Probes) de lapin ont été utilisés pour l'immunofluorescence. Des anticorps IgG anti-lapin, anti-souris et anti-chèvre marqués à la peroxydase ont été utilisés pour le Western blot selon Amersham Biosciences. Pancréatite induite par la caeruleine - Des rats Wistar mâles pesant 200-250 g ont été utilisés. Les animaux étaient hébergés avec un accès gratuit à la nourriture et à l'eau. Les expériences ont été réalisées conformément aux directives éthiques et juridiques standard de l'Administracio ́n Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnologi ́a Medica, Université de Buenos Aires, et aux règlements de l'Union européenne pour les expériences sur les animaux. La pancréatite a été induite par sept injections intrapéritonéales de céruléine (Sigma, 50 μg/kg) administrées à des intervalles de 1 h ; les rats ont été tués par décapitation à différents moments après la première injection. Dans une série d'expériences, le pancréas a été prélevé, homogénéisé dans du tampon HEPES, pH 7,4, contenant des inhibiteurs de protéase (0,5 mm de fluorure de phénylméthylsulfonyle, 5 μg/ml de pepstatine, 5 μg/ml de leupeptine et 2,5 μg/ml d'aprotinine) et traité pour l'analyse Western blot. Dans une autre série d'expériences, le pancréas a été retiré, fixé dans du tampon de formol et traité pour l'immunofluorescence. Souris transgénique - La cassette transgénique a été réalisée à l'aide du vecteur pBEG (25Fernandez-Zapico M.E. Mladek A. Ellenrieder V. Folch-Puy E. Millar L. Urrutia R. EMBO J. 2003 ; 22: 4748-4758Crossref PubMed Scopus (86) Google Scholar). La cassette d'expression contient la région de contrôle spécifique à l'acinaire (-500 à +8) du gène de l'élastase I du rat et la région non traduite de l'hormone de croissance humaine 3′ (+500 à +2657). Cette construction a été digérée avec BamHI, remplie, déphosphorylée et ligaturée avec du VMP1-EGFP de rat libéré à partir du plasmide pEGFP-VMP1. Un fragment HindIII/NotI de 1940 kb a été isolé et utilisé pour des microinjections dans des zygotes de sensibilité de type B du virus Friend consanguin. L'ADN génomique a été préparé et testé par Southern blot ou PCR. L'expression de VMP1 déclenche l'autophagie - Pour savoir si VMP1 déclenche l'autophagie, nous avons transfecté des cellules HeLa avec le plasmide d'expression pcDNA4-VMP1, qui code pour la protéine de fusion VMP1-V5. Le plasmide vide de pcDNA4 a été utilisé chez les témoins. Les cellules ont été cultivées dans des conditions riches en nutriments et en facteurs de croissance et fixées dans du glutaraldéhyde 24 h plus tard pour effectuer une microscopie électronique à transmission. Nous avons constaté que les cellules exprimant VMP1 présentaient de multiples caractéristiques autophagiques. La figure 1A montre des structures en forme de coupe, des structures à double membrane contenant du matériel cytoplasmique (structure de type autophagosome), ainsi que des structures à une seule membrane contenant des constituants cytoplasmiques à différents stades de dégradation (structure de type autolysosome) (26Gozuacik D. Kimchi A. Oncogène. 2004 ; 23: 2891-2906Crossref PubMed Scopus (1254) Google Scholar, 27Klionsky D.J. Nature. 2004 ; 431: 31-32Crossref PubMed Scopus (79) Google Scholar). Les mêmes caractéristiques morphologiques ont été obtenues lorsque les cellules 293T ont été transfectées avec le plasmide d'expression VMP1, et elles ne différaient pas de celles obtenues dans les cellules traitées à la rapamycine (données non présentées). Au cours de l'autophagie, la forme cytosolique de la LC3 (LC3-I) subit des modifications protéolytiques et lipidiques C-terminales (LC3-II) et se transfère du cytosol à la membrane autophagosomique (28Kabeya Y. Mizushima N. Ueno T. Yamamoto A. Kirisako T. Noda T. Kominami E. Ohsumi Y. Yoshimori T. EMBO J. 2000 ; 19: 5720-5728Crossref PubMed Scopus (5433) Google Scholar, 29Mizushima N. Yamamoto A. Matsui M. Yoshimori T. Ohsumi Y. Mol. Biol. Cell. 2004 ; 15: 1101-1111Crossref PubMed Scopus (1923) Google Scholar). La LC3 est actuellement utilisée comme marqueur spécifique de l'autophagie (30Yoshimori T. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004 ; 313: 453-458Crossref PubMed Scopus (462) Google Scholar, 31Klionsky D.J. Cuervo A.M. Seglen P.O. Autophagy. 2007 ; 3: 181-206Crossref PubMed Scopus (557) Google Scholar). Pour confirmer l'étendue et la spécificité de l'induction des autophagosomes VMP1, nous avons d'abord immunocoloré les cellules 293T transfectées par pcDNA4-VMP1 avec un anticorps LC3 spécifique, et nous avons observé le recrutement de LC3 endogènes dans des structures ponctuées compatibles avec l'autophagie (Fig. 1B). Ensuite, nous avons étudié les formes LC3-I et -II par Western blot (Fig. 1C). Nous avons trouvé une induction de LC3 avec un signal de forme LC3-II accru dans les cellules transfectées par pcDNA4-VMP1 (Fig. 1C, voie 1). Parce que la LC3-II intra-autophagosomique est dégradée par les protéases lysosomales, nous avons bloqué sa protéolyse à l'aide de l'inhibiteur de protéase lysosomale E64d (32Tanida I. Minematsu-Ikeguchi N. Ueno T. Kominami E. Autophagy. 2005 ; 1: 84-91Crossref PubMed Scopus (936) Google Scholar), et nous avons constaté que le signal LC3-II était amélioré dans les cellules exprimant VMP1 (Fig. 1C, piste 4). Dans une autre série d'expériences, les cellules HeLa, 293T et NIH3T3 cultivées dans des conditions riches en nutriments et en facteurs cultivés ont été transfectées de manière concomitante avec un plasmide d'expression codant pour la protéine de fusion RFP-LC3 et les plasmides vides pcDNA4-VMP1 ou pcDNA4. La figure 1D montre le recrutement de la protéine de fusion LC3 dans des structures ponctuées dans des cellules transfectées par VMP1, contrairement au signal de protéine de fusion RFP-LC3 diffus observé dans les cellules témoins. Nous déterminons le pourcentage de cellules fluorescentes RFP-LC3 avec coloration ponctuelle dans trois expériences indépendantes par lignée cellulaire comme dans la section « Procédures expérimentales.« Nous avons trouvé un recrutement élevé de LC3 dans les cellules transfectées par VMP1. Enfin, nous avons étudié le potentiel d'inhibition de la voie avec un agent bien documenté pour inhiber l'autophagie. La progression de l'autophagie est sensible aux inhibiteurs de la PI3K tels que la 3-MA, la cible étant la PI3K de classe III (33Petiot A. Ogier-Denis E. Blommaart E.F. Meijer A.J. Codogno P.J. Biol. Chem. 2000 ; 275: 992-998Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1032) Google Scholar). Nous avons traité des cellules avec 3-MA avant la co-transfection avec les plasmides d'expression pRFP-LC3 et pcDNA4-VMP1, et nous avons constaté que le pourcentage de cellules RFP-LC3 avec coloration ponctuée était faible et presque identique à celui observé dans les cellules transfectées vides de pcDNA4 (Fig. 1D). Ces résultats démontrent collectivement que l'expression de VMP1 déclenche l'autophagie dans les cellules de mammifères, même dans des conditions de saturation en nutriments. L'expression de VMP1 est requise pour l'autophagie induite par la stimulation extracellulaire - La voie de trafic de l'autophagie a été décrite pour la première fois comme une adaptation cellulaire à la famine (34Mitchener J.S. Shelburne J.D. Bradford W.D. Hawkins H.K. Am. J. Pathol. 1976 ; 83: 485-491PubMed Google Scholar). Pour déterminer si la famine active l'expression endogène de VMP1, nous avons développé un anticorps polyclonal anti-VMP1 de lapin. Nous avons soumis les cellules HeLa à un protocole standard de famine (milieu privé d'acides aminés/sérum), puis analysé l'évolution temporelle de l'expression de l'ARNm VMP1 par transcription inverse-PCR (Fig. 2A) et de l'expression de la protéine VMP1 par Western blot (Fig. 2B). L'expression de VMP1 a été activée sous l'effet de la famine, et elle était évidente après un traitement de 2 h. De plus, l'expression de VMP1 induite par la famine a été détectée dans des structures ponctuées par immunofluorescence, alors qu'elle n'était presque pas détectable dans des conditions riches en nutriments (Fig. 2C). mTOR kinase joue un rôle central dans le mécanisme de détection du pool d'acides aminés. En réponse à la famine, mTOR est inhibé, ce qui entraîne l'induction de l'autophagie (35Jacinto E. Hall M.N. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2003 ; 4: 117-126Crossref PubMed Scopus (513) Google Scholar). Parce que mTOR peut être inhibé par la rapamycine, nous avons traité les cellules HeLa avec de la rapamycine comme agent pharmacologique pour induire l'autophagie. Nous avons constaté que l'inhibition de mTOR induit l'expression de l'ARNm VMP1 et de la protéine VMP1 (Fig. 2, A-C). Pour établir si VMP1 est nécessaire pour l'autophagie, nous avons réduit l'expression de VMP1 en utilisant la stratégie des petits ARN interférents (siRNA). Les cellules HeLa ont été transfectées avec VMP1-siRNA puis soumises à un protocole standard de famine ou à un traitement à la rapamycine. L'expression de VMP1 a été efficacement détruite (Fig. 2, D et E). Nous avons constaté que la formation d'autophagosomes était presque complètement inhibée dans les cellules d'ARNsi VMP1 sous les deux traitements, comme en témoigne la distribution de la protéine de fusion par fluorescence RFP-LC3 (Fig. 2F). Nous avons analysé trois expériences indépendantes par traitement, et nous avons constaté que le pourcentage de cellules RFP-LC3 avec coloration ponctuée dans les cellules transfectées par l'ARNsi VMP1 était fortement réduit par rapport à celles transfectées par l'ARNsi Scramble (Fig. 2F). Ces résultats montrent que l'expression de VMP1 est nécessaire pour l'autophagie induite par un stimulus extracellulaire. VMP1 reste une protéine membranaire pendant l'autophagie - La structure primaire de VMP1 prédit une protéine transmembranaire (22Dusetti N.J. Jiang Y. Vaccaro M.I. Tomasini R. Samir Azizi A. Calvo E.L. Ropolo A. Fiedler F. Mallo G.V. Dagorn J.C. Iovanna J.L. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002 ; 290: 641-649Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar). La fraction GFP se plie correctement et ne devient fluorescente que si une protéine membranaire est insérée de manière stable dans la membrane (36Wagner S. Bader M.L. Drew D. de Gier J.W. Trends Biotechnol. 2006 ; 24: 364-371Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (211) Google Scholar). Pour vérifier si VMP1 reste dans la structure membranaire, nous avons transfecté des cellules avec le plasmide d'expression pEGFP-VMP1, et les cellules ont été cultivées dans des conditions riches en nutriments et en facteurs cultivés. Après 24 h, la fluorescence GFP de la protéine de fusion VMP1-EGFP a été observée dans les membranes vacuoles induites par sa propre expression (Fig. Nous avons ensuite analysé si VMP1 co-localise avec la LC3 endogène dans les vacuoles induites par VMP1. Nous avons effectué une immunofluorescence en utilisant les anticorps anti-LC3 et anti-V5 dans des cellules HeLa transfectées avec le plasmide d'expression VMP1-V5. Nous avons trouvé une co-localisation remarquable entre la protéine de fusion VMP1-V5 et la LC3 endogène dans les vacuoles induites par VMP1 (Fig. 3B). Pour savoir si le VMP1 endogène reste également une protéine membranaire pendant l'autophagie, nous avons effectué un fractionnement subcellulaire des cellules HeLa subissant une autophagie induite par la rapamycine et avons étudié le VMP1 dans des préparations membranaires par Western blot. La figure 3C montre que, bien que la protéine ne soit pas détectable dans les cellules non traitées, VMP1 se trouve dans les préparations membranaires des cellules subissant une autophagie, et le signal persiste lorsque les fractions membranaires sont traitées avec 1,5 m NaCl ou exposées à un pH de 11,0. Ces résultats indiquent que VMP1 fonctionne comme une protéine membranaire pendant l'autophagie. VMP1 Is a Beclin 1-binding Protein - Pour obtenir un aperçu mécanistique de la façon dont VMP1 déclenche l'autophagie, nous avons analysé sa fonction dans la voie moléculaire de la formation des autophagosomes. Pendant l'autophagie, on pense que le complexe Beclin 1-Class III PI3K (37Kihara A. Kabeya Y. Ohsumi Y. Yoshimori T. EMBO Rep. 2001 ; 2: 330-335Crossref PubMed Scopus (724) Google Scholar) subit une distribution subcellulaire à une structure membranaire, ce qui conduit finalement au recrutement de protéines d'autophagie et à la conjugaison appropriée de LC3 aux phospholipides membranaires (19Kihara A. Noda T. Ishihara N. Ohsumi Y. J. Cell Biol. 2001 ; 152: 519-530Crossref PubMed Scopus (804) Google Scholar, 38Mizushima N. Yamamoto A. Hatano M. Koboyashi Y. Kabeya Y. Suzuki K. Tokuhisa T. Ohsumi Y. Yoshimori T. J. Cell Biol. 2001 ; 152: 657-668Crossref PubMed Scopus (1158) Google Scholar). Cependant, la protéine transmembranaire avec laquelle le complexe Beclin 1 interagit reste insaisissable. Pour déterminer si VMP1 est une protéine membranaire cible avec laquelle Beclin 1 interagit, nous avons d'abord analysé si Beclin 1 se localise dans la membrane des vacuoles induites par VMP1. Nous avons transfecté de manière concomitante des cellules 293T avec des plasmides d'expression pEGFP-VMP1, pRFP-LC3 et pECFP-Beclin 1 (les résultats sont présentés dans la Fig. 4A). Nous avons trouvé une co-localisation remarquable entre les protéines de fusion fluorescentes VMP1, LC3 et Beclin 1, suggérant que Beclin 1 pourrait se fixer aux membranes vacuolaires induites par VMP1. Ensuite, nous avons étudié si VMP1 interagit avec Beclin 1. Nous avons effectué un test de pulldown à l'aide de la protéine de fusion VMP1-V5-His6. Les lysats préparés à partir de cellules HeLa transfectées avec pcDNA4-VMP1 ont été traités avec du Triton X-100 et incubés avec des billes de nickel-agarose. Après un lavage intensif, les protéines retenues ont été éluées avec de l'imidazole et séparées par SDS-PAGE suivi d'une immunoblotting d'anticorps anti-Beclin 1 ou anti-V5. VMP1-V5 et Beclin 1 ont été trouvés dans des éluats (Fig. 4B). Les expériences de contrôle ont montré que ni Beclin 1 ni VMP1-V5 n'ont été détectés dans la fraction d'élution des cellules vides transfectées par pcDNA4. Dans une autre série d'expériences, des lysats de cellules transfectées par pcDNA4-VMP1 ont été incubés avec l'anticorps anti-Beclin 1. Les témoins ont été incubés avec du sérum témoin. Les immunoprécipités ont été séparés et immunodéprimés pour VMP1-V5 avec un anticorps anti-V5. VMP1-V5 a été détecté dans les lysats traités par anticorps Beclin 1 mais pas dans les témoins (Fig. 4C). Pour analyser la pertinence physiologique de l'interaction VMP1-Beclin 1, nous avons examiné si le VMP1 endogène interagit avec le Beclin 1 endogène dans des cellules développant une autophagie induite par la rapamycine par des expériences de co-immunoprécipitation. Beclin endogène 1 an

La autofagia es un proceso de degradación de los constituyentes celulares citoplasmáticos, que sirve como mecanismo de supervivencia en las células hambrientas, y se caracteriza por el secuestro de citoplasma y orgánulos a granel en vesículas de doble membrana llamadas autofagosomas. La autofagia se ha relacionado con una variedad de procesos patológicos como las enfermedades neurodegenerativas y la tumorigénesis, lo que destaca su importancia biológica y médica. Hemos caracterizado previamente el gen de la proteína 1 de la membrana de la vacuola (VMP1), que está altamente activado en la pancreatitis aguda, una enfermedad asociada con cambios morfológicos que se asemejan a la autofagia. Aquí mostramos que la expresión de VMP1 desencadena la autofagia en células de mamíferos. La expresión de VMP1 induce la formación de características ultraestructurales de la autofagia y el reclutamiento de la cadena ligera 3 (LC3) de la proteína 1 asociada a los microtúbulos, que se inhibe después del tratamiento con el inhibidor de la autofagia 3-metiladenina. La VMP1 es inducida por tratamientos de inanición y rapamicina. Su expresión es necesaria para la autofagia, porque el ARN interferente pequeño de VMP1 inhibe la formación de autofagosomas bajo ambos estímulos autofágicos. VMP1 es una proteína transmembrana que se co-localiza con LC3, un marcador de los autofagosomas. Interactúa con Beclin 1, un iniciador de la autofagia de mamíferos, a través del dominio VMP1-Atg, que es esencial para la formación de autofagosomas. La expresión endógena de VMP1 se co-localiza con LC3 en el tejido pancreático sometido a autofagia inducida por pancreatitis. Finalmente, la expresión estable de VMP1 dirigida a las células acinares del páncreas en ratones transgénicos induce la formación de autofagosomas. Nuestros resultados identifican a VMP1 como una nueva proteína de membrana relacionada con la autofagia involucrada en los pasos iniciales del proceso autofágico de las células de mamíferos. La autofagia es un proceso de degradación de los constituyentes celulares citoplasmáticos, que sirve como mecanismo de supervivencia en las células hambrientas, y se caracteriza por el secuestro de citoplasma y orgánulos a granel en vesículas de doble membrana llamadas autofagosomas. La autofagia se ha relacionado con una variedad de procesos patológicos como las enfermedades neurodegenerativas y la tumorigénesis, lo que destaca su importancia biológica y médica. Hemos caracterizado previamente el gen de la proteína 1 de la membrana de la vacuola (VMP1), que está altamente activado en la pancreatitis aguda, una enfermedad asociada con cambios morfológicos que se asemejan a la autofagia. Aquí mostramos que la expresión de VMP1 desencadena la autofagia en células de mamíferos. La expresión de VMP1 induce la formación de características ultraestructurales de la autofagia y el reclutamiento de la cadena ligera 3 (LC3) de la proteína 1 asociada a los microtúbulos, que se inhibe después del tratamiento con el inhibidor de la autofagia 3-metiladenina. La VMP1 es inducida por tratamientos de inanición y rapamicina. Su expresión es necesaria para la autofagia, porque el ARN interferente pequeño de VMP1 inhibe la formación de autofagosomas bajo ambos estímulos autofágicos. VMP1 es una proteína transmembrana que se co-localiza con LC3, un marcador de los autofagosomas. Interactúa con Beclin 1, un iniciador de la autofagia de mamíferos, a través del dominio VMP1-Atg, que es esencial para la formación de autofagosomas. La expresión endógena de VMP1 se co-localiza con LC3 en el tejido pancreático sometido a autofagia inducida por pancreatitis. Finalmente, la expresión estable de VMP1 dirigida a las células acinares del páncreas en ratones transgénicos induce la formación de autofagosomas. Nuestros resultados identifican a VMP1 como una nueva proteína de membrana relacionada con la autofagia involucrada en los pasos iniciales del proceso autofágico de las células de mamíferos. La autofagia es un proceso de degradación evolutivamente conservado de constituyentes celulares citoplasmáticos, que sirve como mecanismo de supervivencia en células hambrientas (1Codogno P. Meijer A.J. Cell Death Differ. 2005; 12: 1509-1518 Crossref PubMed Scopus (946) Google Scholar, 2Kroemer G. Jäättelä M. Nat. Rev. Cancer. 2005; 5: 886-897Crossref PubMed Scopus (1037) Google Scholar, 3Levine B. Klionsky D.J. Dev. Cell. 2004; 6: 463-477Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3189) Google Scholar). Este proceso catabólico está involucrado en la renovación de proteínas de larga vida y otras macromoléculas celulares, y podría desempeñar un papel protector en el desarrollo, el envejecimiento, la muerte celular y la defensa contra patógenos intracelulares (4Hara T. Nakamura K. Matsui M. Yamamoto A. Nakahara Y. Suzuki-Migishima R. Yokoyama M. Mishima K. Saito I. Okano H. Mizushima N. Nature. 2006; 441: 885-889Crossref PubMed Scopus (3108) Google Scholar, 5Komatsu M. Ueno T. Waguri S. Uchiyama Y. Kominami E. Tanaka K. Cell Death Differ. 2007; 14: 887-894Crossref PubMed Scopus (136) Google Scholar, 6Levine B. Cell. 2005; 120: 159-162Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (690) Google Scholar, 7Lum J.J. Bauer D.E. Kong M. Harris M.H. Li C. Lindsten T. Thompson C.B. Cell. 2005; 120: 237-248Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1263) Google Scholar, 8Qu X. Zou Z. Sun Q. Luby-Phelps K. Cheng P. Hogan R. Gilpin C. Levine B. Cell. 2007; 128: 931-946Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (523) Google Scholar). Mediante estudios morfológicos, la autofagia se ha relacionado con una variedad de procesos patológicos como las enfermedades neurodegenerativas y la tumorigénesis, lo que destaca su importancia biológica y médica (4Hara T. Nakamura K. Matsui M. Yamamoto A. Nakahara Y. Suzuki-Migishima R. Yokoyama M. Mishima K. Saito I. Okano H. Mizushima N. Nature. 2006; 441: 885-889Crossref PubMed Scopus (3108) Google Scholar, 9Pattingre S. Levine B. Cancer Res. 2006; 66: 2885-2888Crossref PubMed Scopus (252) Google Scholar, 10Shintani T. Klionsky D.J. Science. 2004; 306: 990-995 Crossref PubMed Scopus (2163) Google Scholar). Los primeros informes de autofagia en enfermedades humanas incluyen las características autofágicas ultraestructurales descritas en el páncreas de la pancreatitis humana (11Helin H. Mero M. Markkula H. Helin M. Virchows Arch. A Pathol. Anat. Histol. 1980; 387: 259-270Crossref PubMed Scopus (63) Google Scholar, 12Willemer S. Klöppel G. Kern H.F. Adler G. Virchows Arch. A Pathol. Anat. Histopathol. 1989; 415: 115-123 Crossref PubMed Scopus (46) Google Scholar). La autofagia se caracteriza por el secuestro de citoplasma y orgánulos a granel en vesículas de doble membrana llamadas autofagosomas, que eventualmente adquieren características similares a las lisosómicas (13Mizushima N. Cell Death Differ. 2005; 12: 1535-1541 Crossref PubMed Scopus (404) Google Scholar, 14Klionsky D.L. Emr S.D. Science. 2000; 290: 1717-1721 Crossref PubMed Scopus (2969) Google Scholar). La autofagia está mediada por un conjunto de productos génicos conservados evolutivamente (denominados proteínas Atg) descubiertos originalmente en levaduras (15Klionsky D.J. Cregg J.M. Dunn Jr., W.A. Emr S.D. Sakai Y. Sandoval I.V. Sibirny A. Subramani S. Thumm M. Veenhuis M. Ohsumi Y. Dev. Cell. 2003; 5: 539-545Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1016) Google Scholar). En células de mamífero, Beclin 1 (3Levine B. Klionsky D.J. Dev. Cell. 2004; 6: 463-477Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3189) Google Scholar, 16Liang X.H. Jackson S. Seaman M. Brown K. Kempkes B. Hibshoosh H. Levine B. Nature. 1999; 402: 672-676Crossref PubMed Scopus (2737) Google Scholar, 17Liang C. Feng P. Ku B. Dotan I. Canaani D. Oh B.H. Jung J.U. Nat. Cell Biol. 2006; 8: 688-699Crossref PubMed Scopus (841) Google Scholar, 18Pattingre S. Tassa A. Qu X. Garuti R. Liang X.H. Mizushima N. Packer M. Schneider M.D. Levine B. Cell. 2005; 122: 927-939Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2931) Google Scholar) promueve la formación de autofagosomas cuando funciona como parte de un complejo con la fosfatidilinositol 3-quinasa de Clase III (PI3K) 6Las abreviaturas utilizadas son: PI3Kfosfatidilinositol 3-quinasaVMP1vacuole membrane protein 1LC3light-chain 3siRNAsmall interfering RNA3-MA3-methyladenineGSTglutathione S-transferaseGFPgreen fluorescent proteinmTORmammalian target of rapamycinAtgautophagy-related domainRFPred fluorescent protein. 6Las abreviaturas utilizadas son:PI3Kfosfatidilinositol 3-quinasaVMP1vacuole membrane protein 1LC3light-chain 3siRNAsmall interfering RNA3-MA3-methyladenineGSTglutathione S-transferaseGFPgreen fluorescent proteinmTORmammalian target of rapamycinAtgautophagy-related domainRFPred fluorescent protein. mediating the localization of other autophagic proteins to the autophagosomal membrane (19Kihara A. Noda T. Ishihara N. Ohsumi Y. J. Cell Biol. 2001; 152: 519-530 Crossref PubMed Scopus (804) Google Scholar). Sin embargo, a pesar de los avances en la comprensión de la autofagia, la formación de autofagosomas en células de mamíferos es un proceso complejo, y ni los mecanismos moleculares ni todos los genes implicados en su formación están completamente dilucidados (20Juhasz G. Neufeld T.P. PLoS Biol. 2006; 4: e36Crossref PubMed Scopus (122) Google Scholar, 21Klionsky D.J. J. Cell Sci. 2005; 118: 7-18Crossref PubMed Scopus (766) Google Scholar). proteína de membrana de vacuola de fosfatidilinositol 3-quinasa 1 cadena ligera 3 ARN interferente pequeño proteína fluorescente verde de 3-metiladenina glutatión S-transferasa diana de mamífero del dominio fluorescente rojo relacionado con la autofagia de rapamicina. proteína de membrana de vacuola de fosfatidilinositol 3-quinasa 1 cadena ligera 3 ARN interferente pequeño proteína fluorescente verde de 3-metiladenina glutatión S-transferasa diana de mamífero del dominio fluorescente rojo relacionado con la autofagia de rapamicina. La proteína asociada a la pancreatitis llamada proteína de membrana de vacuola 1 (VMP1) es una proteína transmembrana sin homólogos conocidos en la levadura. Identificamos el transcrito de VMP1 porque está altamente activado en las células acinares temprano durante la pancreatitis aguda experimental y su expresión transitoria indujo la formación de numerosas vacuolas citoplasmáticas en células de mamíferos (22Dusetti N.J. Jiang Y. Vaccaro M.I. Tomasini R. Samir Azizi A. Calvo E.L. Ropolo A. Fiedler F. Mallo G.V. Dagorn J.C. Iovanna J.L. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002; 290: 641-649Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar). La expresión in situ del ARNm de VMP1 se correlacionó con la formación de vacuolas en las células acinares durante la pancreatitis aguda experimental y en el curso de la pancreatitis crónica en ratas WBN/Kob (23Vaccaro M.I. Grasso D. Ropolo A. Iovanna J.L. Cerquetti M.C. Pancreatology. 2003; 3: 69-74 Crossref PubMed Scopus (34) Google Scholar, 24Jiang P.H. Motoo Y. Vaccaro M.I. Iovanna J.L. Okada G. Sawabu N. Pancreas. 2004; 29: 225-230 Crossref PubMed Scopus (17) Google Scholar). En este estudio probamos la hipótesis de que la expresión de VMP1 está involucrada en el proceso autofágico. Mostramos que VMP1 es una nueva proteína de membrana relacionada con la autofagia que desencadena la formación de autofagosomas en células de mamíferos. La VMP1 es inducida por estímulos de autofagia; es necesaria para el desarrollo del autofagosoma y su expresión desencadena la autofagia, incluso en condiciones repletas de nutrientes. VMP1 interactúa con Beclin 1 a través de su región C-terminal hidrófila, que denominamos dominio Atg porque es esencial para la formación de autofagosomas. También mostramos que VMP1 se localiza conjuntamente con la cadena ligera 3 (LC3) de la proteína 1 asociada a los microtúbulos en las membranas de las vacuolas en el tejido pancreático sometido a autofagia inducida por pancreatitis. Finalmente, descubrimos que la expresión de VMP1 promueve la formación de vacuolas positivas para LC3 cuando se dirige específicamente a las células acinares del páncreas en ratones transgénicos. Líneas celulares, transfecciones y tratamientos de mamíferos: se utilizaron líneas celulares HeLa, 293T y MCF7 humanas y NIH3T3 de ratón (ATCC). Los niveles de Low-Beclin 1 en las células MCF7 se verificaron mediante transferencia Western. Las células se transfectaron usando reactivo FuGENE-6 (Roche Applied Science). Los plásmidos fueron pcDNA4-V5-His (Invitrogen) y pEGFP-N1 (Clontech), que contenían ADNc de VMP1 de rata de longitud completa (NM_138839) (22Dusetti N.J. Jiang Y. Vaccaro M.I. Tomasini R. Samir Azizi A. Calvo E.L. Ropolo A. Fiedler F. Mallo G.V. Dagorn J.C. Iovanna J.L. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002; 290: 641-649Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar) o VMP1ΔAtg subclonado dentro de los sitios de restricción HindIII y BamHI. El ADNc de Beclin 1 humano de longitud completa (NM_003766) se subclonó en pECFP-C1 (Clontech) dentro del EcoRI y SalI o en pcDNA3 (Invitrogen) dentro de los sitios de restricción EcoRI y ApaI. El pRFP-C1 que contiene LC3 de rata de longitud completa fue proporcionado amablemente por la Dra. Maria I. Colombo (Universidad Nacional de Cuyo, Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Argentina). Las células también se transfectaron usando transferencia mediada por Oligofectamina (Invitrogen) con ARNip prediseñado para ARNm de VMP1 humano usando 5'-GGCAGAAUAUUGUCCUGUGtt-3', como sentido, y 5'-CACAGGACAAUAUUCUCUGCCtt-3', como antisentido (Ambion ID32935) y 24 h más tarde, las células se sometieron a estímulos de autofagia durante un período adicional de 6 h. Para la inhibición de la autofagia, las células se trataron con 3-metiladenina (3-MA) (Sigma) 10 mm 2 h antes y durante la cotransfección con pcDNA4-VMP1 y pRFP-LC3. La eficacia del tratamiento con 3-MA se verificó en células hambrientas (datos no mostrados). Para la inhibición de la hidrolasa lisosomal, las células se trataron con E64d (10 μg/ml) durante 4 h antes del procesamiento. La autofagia fue inducida por medio privado de aminoácidos/suero utilizando la solución salina equilibrada de Earle (Invitrogen) o tratamientos con rapamicina de 55 μm (Calbiochem). La fluorescencia se observó utilizando un microscopio de fluorescencia Nikon Eclypse 200 (Plan100 ×), un microscopio de fluorescencia invertida Olympus GX71, un microscopio confocal Nikon Eclipse C1 (Plan40 ×/0.95 y Plan60 ×/1.40), o un microscopio confocal invertido Olympus FV1000 (PLAPO N/1.42). Microscopía electrónica de transmisión: las celdas se fijaron sin ser puestas en suspensión y se procesaron para microscopía electrónica de transmisión mediante procedimientos estándar. Las cuadrículas se examinaron bajo un microscopio electrónico Carl Zeiss C-10 (Laboratorio Nacional de Investigación y Servicios en Microscopía Electrónica, Universidad de Buenos Aires). Porcentaje de células RFP-LC3 con tinción punteada: se determinó el número de células con tinción punteada por 100 células transfectadas con RFP-LC3 fluorescente en tres experimentos independientes. Para cuantificar, el número de células fluorescentes con tinción punteada se contó en seis campos aleatorios que representan 100 células fluorescentes y se expresó como la media ± DE de los resultados combinados. Consideramos que una célula RFP-LC3 tiene tinción punteada cuando toda la fluorescencia roja está presente como punteada y no queda proteína difusa. Los péptidos GST-VMP1 recombinantes y los péptidos hidrófilos de proteína His6-Beclin 1-VMP1 se amplificaron a partir de pcDNA4-VMP1 mediante PCR y se subclonaron en pGEX-5X-2 (Amersham Biosciences) para obtener péptidos GST-VMP1. Los péptidos se expresaron en Escherichia coli BL21 y se purificaron mediante cromatografía de afinidad con glutatión (Amersham Biosciences). El ADNc de Beclin 1 se obtuvo a partir de extractos de ARN total de células HeLa y se clonó en pQE31 (Qiagen). His6-Beclin 1 se expresó en E. coli M15 y se purificó usando perlas de níquel-ácido nitrilotriacético-agarosa (Qiagen). Aislamiento de membrana: las células se lavaron y homogeneizaron con un homogeneizador de mano de mortero de teflón accionado por motor en tampón SBE enfriado con hielo (sacarosa 250 mm, EGTA 1 mm, Hepes/Koh 10 mm, pH 7,5) que contenía inhibidores de proteasa. Los homogeneizados se centrifugaron dos veces a 500 × g durante 15 min. Los sobrenadantes resultantes se centrifugaron a 100.000 × g durante 1 h. Los sedimentos de membrana se resuspendieron en amortiguador SBE enfriado con hielo y se trataron con Nonidet P-40 al 1% (Nonidet P-40), Na2CO3 0.2 m, pH 11.0 o NaCl 1.5 m. Todos los pasos se realizaron a 4 °C. Los sedimentos de membrana se obtuvieron por centrifugación y las proteínas retenidas se separaron por SDS-PAGE. El análisis de transferencia Western se realizó utilizando como anticuerpo secundario un anticuerpo IgG marcado con peroxidasa proporcionado con el kit ECL (Amersham Biosciences). La inmunotransferencia se realizó utilizando el kit ECL y las membranas se expusieron a una película Kodak BioMax. Ensayos de extracción: las células HeLa transfectadas con los plásmidos vacíos pcDNA4-VMP1, pcDNA4-VMP1ΔAtg y pcDNA4 se lisaron mediante sonicación y se solubilizaron con Triton X-100 al 1%, seguido de una centrifugación de 30 minutos a 100.000 × g. Los sobrenadantes que contenían proteínas marcadas con His se incubaron con perlas de níquel-ácido nitrilotriacético-agarosa (Qiagen) durante 2 h a 4 °C, se lavaron exhaustivamente con un tampón que contenía imidazol 5 mm y se eluyeron con un tampón que contenía imidazol 120 mm. Las proteínas se separaron por SDS-PAGE y se transfirieron a nitrocelulosa para inmunotransferencia. En otro experimento, His6-Beclin 1 producido en E. coli se incubó en perlas de níquel-ácido nitrilotriacético-agarosa con los péptidos GST-VMP1 purificados. Ensayos de coinmunoprecipitación: para los ensayos de coinmunoprecipitación, el sobrenadante de los lisados de células transfectadas con pcDNA4-VMP1 o tratadas con rapamicina se incubó con antisueros unidos a perlas de proteína A-Sepharose™ Cl-4B (Amersham Biosciences) durante 2 h a 4 °C y se lavó exhaustivamente. Las proteínas unidas se eluyeron con glicina-HCl 100 mm, pH 2,5, se precipitaron con ácido tricloroacético al 5%, se lavaron con acetona helada y se resuspendieron en un tampón de muestra SDS. Anticuerpos: se obtuvo antisuero policlonal de conejo contra VMP1 contra el péptido MAQSYAKRIQQRLNSEEKTK (residuos 386-406) y se utilizó a una dilución de 1:100. Se utilizaron anticuerpos policlonales de cabra anti-LC3, de cabra anti-Beclin 1, de conejo anti-GST, monoclonales de ratón anti-GFP (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), monoclonales de ratón anti-V5 (Invitrogen) según el fabricante. Se utilizaron anticuerpos de burro anti-conejo y anti-cabra Alexa Fluor 488 y 590, y de conejo anti-ratón Alexa Fluor 590 (Molecular Probes) para la inmunofluorescencia. Se utilizaron anticuerpos IgG anti-conejo, anti-ratón y anti-cabra marcados con peroxidasa para la transferencia Western de acuerdo con Amersham Biosciences. Pancreatitis inducida por ceruleína: se utilizaron ratas Wistar macho que pesaban 200-250 g. Los animales fueron alojados con libre acceso a alimentos y agua. Los experimentos se realizaron de acuerdo con las pautas éticas y legales estándar de la Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Médica, Universidad de Buenos Aires y las regulaciones de la Unión Europea para experimentos con animales. La pancreatitis se indujo mediante siete inyecciones intraperitoneales de caeruleína (Sigma, 50 μg/kg) administradas a intervalos de 1 h; las ratas se sacrificaron por decapitación en diferentes momentos después de la primera inyección. En una serie de experimentos, se extirpó el páncreas, se homogeneizó en tampón HEPES, pH 7,4, que contenía inhibidores de proteasa (0,5 mm de fluoruro de fenilmetilsulfonilo, 5 μg/ml de pepstatina, 5 μg/ml de leupeptina y 2,5 μg/ml de aprotinina) y se procesó para el análisis de transferencia Western. En otra serie de experimentos, se extirparon los páncreas, se fijaron en tampón de formalina y se procesaron para inmunofluorescencia. Ratones transgénicos: el casete transgénico se preparó utilizando el vector pBEG (25Fernandez-Zapico M.E. Mladek A. Ellenrieder V. Folch-Puy E. Millar L. Urrutia R. EMBO J. 2003; 22: 4748-4758Crossref PubMed Scopus (86) Google Scholar). El casete de expresión contiene la región de control específica de acinar (-500 a +8) del gen de la elastasa I de rata y la región no traducida 3'de la hormona del crecimiento humana (+500 a +2657). Esta construcción se digirió con BamHI, se rellenó, se desfosforiló y se ligó con VMP1-EGFP de rata liberada del plásmido pEGFP-VMP1. Se aisló un fragmento HindIII/NotI de 1940 kb y se utilizó para microinyecciones en cigotos de susceptibilidad de tipo B del virus Friend endogámicos. El ADN genómico se preparó y probó mediante transferencia Southern o PCR. La expresión de VMP1 desencadena la autofagia: para saber si VMP1 desencadena la autofagia, transfectamos células HeLa con el plásmido de expresión pcDNA4-VMP1, que codifica la proteína de fusión VMP1-V5. El plásmido vacío de pcDNA4 se utilizó en los controles. Las células se cultivaron en condiciones de nutrientes y factor de crecimiento completo y se fijaron en glutaraldehído 24 h más tarde para realizar microscopía electrónica de transmisión. Descubrimos que las células que expresaban VMP1 mostraban múltiples características autofágicas. La Fig. 1A muestra estructuras en forma de copa, estructuras de doble membrana que contienen material citoplasmático (estructura similar a un autofagosoma), así como estructuras de una sola membrana que contienen constituyentes citoplasmáticos en diferentes etapas de degradación (estructura similar a un autolisosoma) (26Gozuacik D. Kimchi A. Oncogene. 2004; 23: 2891-2906 Crossref PubMed Scopus (1254) Google Scholar, 27Klionsky D.J. Nature. 2004; 431: 31-32 Crossref PubMed Scopus (79) Google Scholar). Se obtuvieron las mismas características morfológicas cuando se transfectaron células 293T con el plásmido de expresión de VMP1, y no difirieron de las obtenidas en células tratadas con rapamicina (datos no mostrados). Durante la autofagia, la forma citosólica de LC3 (LC3-I) experimenta modificaciones proteolíticas y lipídicas C-terminales (LC3-II) y se transloca del citosol a la membrana autofagosómica (28Kabeya Y. Mizushima N. Ueno T. Yamamoto A. Kirisako T. Noda T. Kominami E. Ohsumi Y. Yoshimori T. EMBO J. 2000; 19: 5720-5728Crossref PubMed Scopus (5433) Google Scholar, 29Mizushima N. Yamamoto A. Matsui M. Yoshimori T. Ohsumi Y. Mol. Biol. Cell. 2004; 15: 1101-1111Crossref PubMed Scopus (1923) Google Scholar). LC3 se utiliza actualmente como marcador específico de autofagia (30Yoshimori T. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004; 313: 453-458Crossref PubMed Scopus (462) Google Scholar, 31Klionsky D.J. Cuervo A.M. Seglen P.O. Autophagy. 2007; 3: 181-206 Crossref PubMed Scopus (557) Google Scholar). Para confirmar el alcance y la especificidad de la inducción del autofagosoma VMP1, primero inmunoteñimos células 293T transfectadas con pcDNA4-VMP1 con un anticuerpo LC3 específico, y observamos el reclutamiento de LC3 endógeno en estructuras punteadas consistentes con la autofagia (Fig. 1B). Luego, investigamos las formas LC3-I y -II mediante Western blot (Fig. 1C). Encontramos inducción de LC3 con aumento de la señal de la forma LC3-II en células transfectadas con pcDNA4-VMP1 (Fig. 1C, carril 1). Debido a que la LC3-II intraautofagosómica es degradada por las proteasas lisosómicas, bloqueamos su proteólisis utilizando el inhibidor de la proteasa lisosómica E64d (32Tanida I. Minematsu-Ikeguchi N. Ueno T. Kominami E. Autophagy. 2005; 1: 84-91 Crossref PubMed Scopus (936) Google Scholar), y encontramos que la señal LC3-II se mejoró en las células que expresan VMP1 (Fig. 1C, carril 4). En otra serie de experimentos, las células HeLa, 293T y NIH3T3 cultivadas en condiciones de nutrientes y factor de crecimiento completo se transfectaron concomitantemente con un plásmido de expresión que codifica la proteína de fusión RFP-LC3 y plásmidos vacíos pcDNA4-VMP1 o pcDNA4. La Fig. 1D muestra el reclutamiento de la proteína de fusión LC3 en estructuras punteadas en células transfectadas con VMP1 en contraste con la señal difusa de la proteína de fusión RFP-LC3 observada en las células de control. Determinamos el porcentaje de células RFP-LC3 fluorescentes con tinción punteada en tres experimentos independientes por línea celular como en "Procedimientos experimentales." Encontramos un alto reclutamiento de LC3 en células transfectadas con VMP1. Finalmente, investigamos el potencial de inhibición de la vía con un agente bien documentado para inhibir la autofagia. La progresión de la autofagia es sensible a los inhibidores de PI3K como 3-MA, siendo el objetivo PI3K de Clase III (33Petiot A. Ogier-Denis E. Blommaart E.F. Meijer A.J. Codogno P.J. Biol. Chem. 2000; 275: 992-998Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1032) Google Scholar). Tratamos las células con 3-MA antes de la cotransfección con los plásmidos de expresión pRFP-LC3 y pcDNA4-VMP1, y descubrimos que el porcentaje de células RFP-LC3 con tinción punteada era bajo y casi el mismo que el observado en las células transfectadas vacías de pcDNA4 (Fig. 1D). Estos resultados demuestran colectivamente que la expresión de VMP1 desencadena la autofagia en células de mamíferos, incluso en condiciones repletas de nutrientes. Se requiere la expresión de VMP1 para la autofagia inducida por estímulos extracelulares: la vía de tráfico de autofagia se describió por primera vez como una adaptación celular a la inanición (34Mitchener J.S. Shelburne J.D. Bradford W.D. Hawkins H.K. Am. J. Pathol. 1976; 83: 485-491PubMed Google Scholar). Para investigar si la inanición activa la expresión endógena de VMP1, desarrollamos un anticuerpo policlonal de conejo anti-VMP1. Sometimos a las células HeLa a un protocolo estándar de inanición (medio privado de aminoácidos/suero) y luego analizamos el curso temporal de la expresión de ARNm de VMP1 mediante PCR de transcripción inversa (Fig. 2A) y de la expresión de la proteína VMP1 mediante transferencia Western (Fig. 2B). La expresión de VMP1 se activó bajo inanición, y fue evidente después del tratamiento de 2 h. Además, la expresión de VMP1 inducida por inanición se detectó en estructuras punteadas por inmunofluorescencia, mientras que casi no fue detectable en condiciones repletas de nutrientes (Fig. 2C). La quinasa mTOR desempeña un papel central en el mecanismo de detección del grupo de aminoácidos. En respuesta a la inanición, mTOR se inhibe, lo que resulta en la inducción de la autofagia (35Jacinto E. Hall M.N. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2003; 4: 117-126 Crossref PubMed Scopus (513) Google Scholar). Debido a que la rapamicina puede inhibir la mTOR, tratamos las células HeLa con rapamicina como agente farmacológico para inducir la autofagia. Descubrimos que la inhibición de mTOR induce la expresión de ARNm de VMP1 y proteína VMP1 (Fig. 2, A-C). Para establecer si se requiere VMP1 para la autofagia, redujimos la expresión de VMP1 utilizando la estrategia de ARN de interferencia pequeño (ARNip). Las células HeLa se transfectaron con VMP1-ARNip y luego se sometieron a un protocolo estándar de inanición o tratamiento con rapamicina. La expresión de VMP1 se derribó de manera eficiente (Fig. 2, D y E). Encontramos que la formación de autofagosomas se inhibió casi por completo en células VMP1-ARNip bajo ambos tratamientos, como lo demuestra la distribución de la proteína de fusión de fluorescencia RFP-LC3 (Fig. 2F). Analizamos tres experimentos independientes por tratamiento, y encontramos que el porcentaje de células RFP-LC3 con tinción punteada en células transfectadas con VMP1-ARNip estaba muy reducido en comparación con las transfectadas con ARNip aleatorizado (Fig. 2F). Estos hallazgos muestran que la expresión de VMP1 es necesaria para la autofagia inducida por estímulos extracelulares. VMP1 permanece como una proteína de membrana durante la autofagia: la estructura primaria de VMP1 predice una proteína transmembrana (22Dusetti N.J. Jiang Y. Vaccaro M.I. Tomasini R. Samir Azizi A. Calvo E.L. Ropolo A. Fiedler F. Mallo G.V. Dagorn J.C. Iovanna J.L. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002; 290: 641-649Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar). El resto GFP se pliega correctamente y se vuelve fluorescente solo si una proteína de membrana se inserta de forma estable en la membrana (36Wagner S. Bader M.L. Drew D. de Gier J.W. Trends Biotechnol. 2006; 24: 364-371Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (211) Google Scholar). Para verificar si VMP1 permanece en la estructura de membrana, transfectamos células con el plásmido de expresión pEGFP-VMP1, y las células se cultivaron en condiciones de nutrientes y factor de crecimiento completo. Después de 24 h, se observó la fluorescencia de GFP de la proteína de fusión VMP1-EGFP en membranas de vacuola inducida por su propia expresión (Fig. 3A). Luego analizamos si VMP1 se localiza conjuntamente con LC3 endógena en las vacuolas inducidas por VMP1. Realizamos inmunofluorescencia utilizando los anticuerpos anti-LC3 y anti-V5 en células HeLa transfectadas con el plásmido de expresión VMP1-V5. Encontramos una notable co-localización entre la proteína de fusión VMP1-V5 y LC3 endógena en vacuolas inducidas por VMP1 (Fig. 3B). Para saber si la VMP1 endógena también permanece como una proteína de membrana durante la autofagia, realizamos el fraccionamiento subcelular de células HeLa sometidas a autofagia inducida por rapamicina e investigamos VMP1 en preparaciones de membrana mediante transferencia Western. La Fig. 3C muestra que, aunque la proteína no es detectable en células no tratadas, VMP1 se encuentra en las preparaciones de membrana de células sometidas a autofagia, y la señal persiste cuando las fracciones de membrana se tratan con NaCl 1,5 m o se exponen a pH 11,0. Estos resultados indican que VMP1 funciona como una proteína de membrana durante la autofagia. VMP1 es una proteína de unión a Beclin 1: para obtener una visión mecanicista de cómo VMP1 desencadena la autofagia, analizamos su función en la vía molecular de la formación del autofagosoma. Durante la autofagia, se cree que el complejo Beclin 1-Class III PI3K (37Kihara A. Kabeya Y. Ohsumi Y. Yoshimori T. EMBO Rep. 2001; 2: 330-335Crossref PubMed Scopus (724) Google Scholar) experimenta una distribución subcelular a una estructura de membrana, lo que finalmente conduce al reclutamiento de proteínas de autofagia y a la conjugación adecuada de LC3 con fosfolípidos de membrana (19Kihara A. Noda T. Ishihara N. Ohsumi Y. J. Cell Biol. 2001; 152: 519-530 Crossref PubMed Scopus (804) Google Scholar, 38Mizushima N. Yamamoto A. Hatano M. Koboyashi Y. Kabeya Y. Suzuki K. Tokuhisa T. Ohsumi Y. Yoshimori T. J. Cell Biol. 2001; 152: 657-668 Crossref PubMed Scopus (1158) Google Scholar). Sin embargo, la proteína transmembrana con la que interactúa el complejo Beclin 1 sigue siendo difícil de alcanzar. Para investigar si VMP1 es una proteína de membrana diana con la que interactúa Beclin 1, primero analizamos si Beclin 1 se localiza en la membrana de las vacuolas inducidas por VMP1. Transfectamos concomitantemente células 293T con plásmidos de expresión pEGFP-VMP1, pRFP-LC3 y pECFP-Beclin 1 (los resultados se muestran en la Fig. 4A). Encontramos una notable colocalización entre las proteínas de fusión fluorescentes VMP1, LC3 y Beclin 1, lo que sugiere que Beclin 1 podría unirse a las membranas de vacuola inducidas por VMP1. Luego, estudiamos si VMP1 interactúa con Beclin 1. Realizamos un ensayo de pulldown utilizando la proteína de fusión VMP1-V5-His6. Los lisados preparados a partir de células HeLa transfectadas con pcDNA4-VMP1 se trataron con Triton X-100 y se incubaron con perlas de níquel-agarosa. Después de un lavado exhaustivo, las proteínas retenidas se eluyeron con imidazol y se separaron por SDS-PAGE seguido de inmunotransferencia de anticuerpo anti-Beclin 1 o anti-V5. VMP1-V5 y Beclin 1 se encontraron en eluatos (Fig. 4B). Los experimentos de control mostraron que ni Beclin 1 ni VMP1-V5 se detectaron en la fracción de elución de las células transfectadas con pcDNA4 vacío. En otra serie de experimentos, se incubaron lisados de células transfectadas con pcDNA4-VMP1 con el anticuerpo anti-Beclin 1. Los controles se incubaron con suero de control. Los inmunoprecipitados se separaron y se inmunotransfirieron para VMP1-V5 con anticuerpo anti-V5. Se detectó VMP1-V5 en lisados tratados con anticuerpo Beclin 1 pero no en los controles (Fig. 4C). Para analizar la relevancia fisiológica de la interacción VMP1-Beclin 1, investigamos si VMP1 endógeno interactúa con Beclin 1 endógeno en células que desarrollan autofagia inducida por rapamicina mediante experimentos de coinmunoprecipitación. Beclin endógeno 1 an

Autophagy is a degradation process of cytoplasmic cellular constituents, which serves as a survival mechanism in starving cells, and it is characterized by sequestration of bulk cytoplasm and organelles in double-membrane vesicles called autophagosomes. Autophagy has been linked to a variety of pathological processes such as neurodegenerative diseases and tumorigenesis, which highlights its biological and medical importance. We have previously characterized the vacuole membrane protein 1 (VMP1) gene, which is highly activated in acute pancreatitis, a disease associated with morphological changes resembling autophagy. Here we show that VMP1 expression triggers autophagy in mammalian cells. VMP1 expression induces the formation of ultrastructural features of autophagy and recruitment of the microtubule-associated protein 1 light-chain 3 (LC3), which is inhibited after treatment with the autophagy inhibitor 3-methiladenine. VMP1 is induced by starvation and rapamycin treatments. Its expression is necessary for autophagy, because VMP1 small interfering RNA inhibits autophagosome formation under both autophagic stimuli. VMP1 is a transmembrane protein that co-localizes with LC3, a marker of the autophagosomes. It interacts with Beclin 1, a mammalian autophagy initiator, through the VMP1-Atg domain, which is essential for autophagosome formation. VMP1 endogenous expression co-localizes with LC3 in pancreas tissue undergoing pancreatitis-induced autophagy. Finally, VMP1 stable expression targeted to pancreas acinar cell in transgenic mice induces autophagosome formation. Our results identify VMP1 as a novel autophagy-related membrane protein involved in the initial steps of the mammalian cell autophagic process. Autophagy is a degradation process of cytoplasmic cellular constituents, which serves as a survival mechanism in starving cells, and it is characterized by sequestration of bulk cytoplasm and organelles in double-membrane vesicles called autophagosomes. Autophagy has been linked to a variety of pathological processes such as neurodegenerative diseases and tumorigenesis, which highlights its biological and medical importance. We have previously characterized the vacuole membrane protein 1 (VMP1) gene, which is highly activated in acute pancreatitis, a disease associated with morphological changes resembling autophagy. Here we show that VMP1 expression triggers autophagy in mammalian cells. VMP1 expression induces the formation of ultrastructural features of autophagy and recruitment of the microtubule-associated protein 1 light-chain 3 (LC3), which is inhibited after treatment with the autophagy inhibitor 3-methiladenine. VMP1 is induced by starvation and rapamycin treatments. Its expression is necessary for autophagy, because VMP1 small interfering RNA inhibits autophagosome formation under both autophagic stimuli. VMP1 is a transmembrane protein that co-localizes with LC3, a marker of the autophagosomes. It interacts with Beclin 1, a mammalian autophagy initiator, through the VMP1-Atg domain, which is essential for autophagosome formation. VMP1 endogenous expression co-localizes with LC3 in pancreas tissue undergoing pancreatitis-induced autophagy. Finally, VMP1 stable expression targeted to pancreas acinar cell in transgenic mice induces autophagosome formation. Our results identify VMP1 as a novel autophagy-related membrane protein involved in the initial steps of the mammalian cell autophagic process. Autophagy is an evolutionarily preserved degradation process of cytoplasmic cellular constituents, which serves as a survival mechanism in starving cells (1Codogno P. Meijer A.J. Cell Death Differ. 2005; 12: 1509-1518Crossref PubMed Scopus (946) Google Scholar, 2Kroemer G. Jäättelä M. Nat. Rev. Cancer. 2005; 5: 886-897Crossref PubMed Scopus (1037) Google Scholar, 3Levine B. Klionsky D.J. Dev. Cell. 2004; 6: 463-477Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3189) Google Scholar). This catabolic process is involved in the turnover of long lived proteins and other cellular macromolecules, and it might play a protective role in development, aging, cell death, and defense against intracellular pathogens (4Hara T. Nakamura K. Matsui M. Yamamoto A. Nakahara Y. Suzuki-Migishima R. Yokoyama M. Mishima K. Saito I. Okano H. Mizushima N. Nature. 2006; 441: 885-889Crossref PubMed Scopus (3108) Google Scholar, 5Komatsu M. Ueno T. Waguri S. Uchiyama Y. Kominami E. Tanaka K. Cell Death Differ. 2007; 14: 887-894Crossref PubMed Scopus (136) Google Scholar, 6Levine B. Cell. 2005; 120: 159-162Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (690) Google Scholar, 7Lum J.J. Bauer D.E. Kong M. Harris M.H. Li C. Lindsten T. Thompson C.B. Cell. 2005; 120: 237-248Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1263) Google Scholar, 8Qu X. Zou Z. Sun Q. Luby-Phelps K. Cheng P. Hogan R. Gilpin C. Levine B. Cell. 2007; 128: 931-946Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (523) Google Scholar). By morphological studies, autophagy has been linked to a variety of pathological processes such as neurodegenerative diseases and tumorigenesis, which highlights its biological and medical importance (4Hara T. Nakamura K. Matsui M. Yamamoto A. Nakahara Y. Suzuki-Migishima R. Yokoyama M. Mishima K. Saito I. Okano H. Mizushima N. Nature. 2006; 441: 885-889Crossref PubMed Scopus (3108) Google Scholar, 9Pattingre S. Levine B. Cancer Res. 2006; 66: 2885-2888Crossref PubMed Scopus (252) Google Scholar, 10Shintani T. Klionsky D.J. Science. 2004; 306: 990-995Crossref PubMed Scopus (2163) Google Scholar). Early reports of autophagy in human disease include the ultrastructural autophagic features described in pancreas from human pancreatitis (11Helin H. Mero M. Markkula H. Helin M. Virchows Arch. A Pathol. Anat. Histol. 1980; 387: 259-270Crossref PubMed Scopus (63) Google Scholar, 12Willemer S. Klöppel G. Kern H.F. Adler G. Virchows Arch. A Pathol. Anat. Histopathol. 1989; 415: 115-123Crossref PubMed Scopus (46) Google Scholar). Autophagy is characterized by sequestration of bulk cytoplasm and organelles in double-membrane vesicles called autophagosomes, which eventually acquire lysosomal-like features (13Mizushima N. Cell Death Differ. 2005; 12: 1535-1541Crossref PubMed Scopus (404) Google Scholar, 14Klionsky D.L. Emr S.D. Science. 2000; 290: 1717-1721Crossref PubMed Scopus (2969) Google Scholar). Autophagy is mediated by a set of evolutionarily conserved gene products (termed the Atg proteins) originally discovered in yeast (15Klionsky D.J. Cregg J.M. Dunn Jr., W.A. Emr S.D. Sakai Y. Sandoval I.V. Sibirny A. Subramani S. Thumm M. Veenhuis M. Ohsumi Y. Dev. Cell. 2003; 5: 539-545Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1016) Google Scholar). In mammalian cells, Beclin 1 (3Levine B. Klionsky D.J. Dev. Cell. 2004; 6: 463-477Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (3189) Google Scholar, 16Liang X.H. Jackson S. Seaman M. Brown K. Kempkes B. Hibshoosh H. Levine B. Nature. 1999; 402: 672-676Crossref PubMed Scopus (2737) Google Scholar, 17Liang C. Feng P. Ku B. Dotan I. Canaani D. Oh B.H. Jung J.U. Nat. Cell Biol. 2006; 8: 688-699Crossref PubMed Scopus (841) Google Scholar, 18Pattingre S. Tassa A. Qu X. Garuti R. Liang X.H. Mizushima N. Packer M. Schneider M.D. Levine B. Cell. 2005; 122: 927-939Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2931) Google Scholar) promotes autophagosome formation when it functions as part of a complex with the Class III phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) 6The abbreviations used are:PI3Kphosphatidylinositol 3-kinaseVMP1vacuole membrane protein 1LC3light-chain 3siRNAsmall interfering RNA3-MA3-methyladenineGSTglutathione S-transferaseGFPgreen fluorescent proteinmTORmammalian target of rapamycinAtgautophagy-related domainRFPred fluorescent protein. 6The abbreviations used are:PI3Kphosphatidylinositol 3-kinaseVMP1vacuole membrane protein 1LC3light-chain 3siRNAsmall interfering RNA3-MA3-methyladenineGSTglutathione S-transferaseGFPgreen fluorescent proteinmTORmammalian target of rapamycinAtgautophagy-related domainRFPred fluorescent protein. mediating the localization of other autophagic proteins to the autophagosomal membrane (19Kihara A. Noda T. Ishihara N. Ohsumi Y. J. Cell Biol. 2001; 152: 519-530Crossref PubMed Scopus (804) Google Scholar). However, despite the advances in understanding autophagy, autophagosome formation in mammalian cells is a complex process, and neither the molecular mechanisms nor all the implicated genes involved in its formation are fully elucidated (20Juhasz G. Neufeld T.P. PLoS Biol. 2006; 4: e36Crossref PubMed Scopus (122) Google Scholar, 21Klionsky D.J. J. Cell Sci. 2005; 118: 7-18Crossref PubMed Scopus (766) Google Scholar). phosphatidylinositol 3-kinase vacuole membrane protein 1 light-chain 3 small interfering RNA 3-methyladenine glutathione S-transferase green fluorescent protein mammalian target of rapamycin autophagy-related domain red fluorescent protein. phosphatidylinositol 3-kinase vacuole membrane protein 1 light-chain 3 small interfering RNA 3-methyladenine glutathione S-transferase green fluorescent protein mammalian target of rapamycin autophagy-related domain red fluorescent protein. The pancreatitis-associated protein named vacuole membrane protein 1 (VMP1) is a transmembrane protein with no known homologues in yeast. We identified the VMP1 transcript because it is highly activated in acinar cells early during experimental acute pancreatitis and its transient expression induced the formation of numerous cytoplasmic vacuoles in mammalian cells (22Dusetti N.J. Jiang Y. Vaccaro M.I. Tomasini R. Samir Azizi A. Calvo E.L. Ropolo A. Fiedler F. Mallo G.V. Dagorn J.C. Iovanna J.L. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002; 290: 641-649Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar). VMP1 mRNA in situ expression correlated with the formation of vacuoles in acinar cells during experimental acute pancreatitis and in the course of chronic pancreatitis in WBN/Kob rats (23Vaccaro M.I. Grasso D. Ropolo A. Iovanna J.L. Cerquetti M.C. Pancreatology. 2003; 3: 69-74Crossref PubMed Scopus (34) Google Scholar, 24Jiang P.H. Motoo Y. Vaccaro M.I. Iovanna J.L. Okada G. Sawabu N. Pancreas. 2004; 29: 225-230Crossref PubMed Scopus (17) Google Scholar). In this study we tested the hypothesis that VMP1 expression is involved in the autophagic process. We show that VMP1 is a novel autophagy-related membrane protein that triggers autophagosome formation in mammalian cells. VMP1 is induced by autophagy stimuli; it is required for autophagosome development and its expression triggers autophagy, even under nutrient-replete conditions. VMP1 interacts with Beclin 1 through its hydrophilic C-terminal region, which we named Atg domain because it is essential for autophagosome formation. We also show that VMP1 co-localizes with the microtubule-associated protein 1 light chain 3 (LC3) in vacuole membranes in pancreas tissue undergoing pancreatitis-induced autophagy. Finally, we found that VMP1 expression promotes the formation of LC3-positive vacuoles when specifically targeted to the pancreas acinar cells in transgenic mice. Mammalian Cell Lines, Transfections, and Treatments—Human HeLa, 293T and MCF7, and mouse NIH3T3 (ATCC) cell lines were used. Low-Beclin 1 levels in MCF7 cells were verified by Western blot. Cells were transfected using FuGENE-6 reagent (Roche Applied Science). Plasmids were pcDNA4-V5-His (Invitrogen) and pEGFP-N1 (Clontech), containing full-length rat VMP1 cDNA (NM_138839) (22Dusetti N.J. Jiang Y. Vaccaro M.I. Tomasini R. Samir Azizi A. Calvo E.L. Ropolo A. Fiedler F. Mallo G.V. Dagorn J.C. Iovanna J.L. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002; 290: 641-649Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar) or VMP1ΔAtg subcloned within the HindIII and BamHI restriction sites. Full-length human Beclin 1 cDNA (NM_003766) was subcloned into pECFP-C1 (Clontech) within the EcoRI and SalI or into pcDNA3 (Invitrogen) within EcoRI and ApaI restriction sites. pRFP-C1 containing full-length rat LC3 was kindly provided by Dr. Maria I. Colombo (Universidad Nacional de Cuyo, Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Argentina). Cells were also transfected using Oligofectamine (Invitrogen)-mediated transfer with siRNA pre-designed for human VMP1 mRNA using 5′-GGCAGAAUAUUGUCCUGUGtt-3′, as sense, and 5′-CACAGGACAAUAUUCUCUGCCtt-3′, as antisense (Ambion ID32935) and 24 h later, cells were subjected to autophagy stimuli for an additional 6-h period. For autophagy inhibition, cells were treated with 10 mm 3-methyladenine (3-MA) (Sigma) 2 h before and during co-transfection with pcDNA4-VMP1 and pRFP-LC3. The efficacy of 3-MA treatment was verified on starved cells (data not shown). For lysosomal hydrolase inhibition, cells were treated with E64d (10 μg/ml) for 4 h before processed. Autophagy was induced by amino acid/serum-deprived medium using Earle's balanced salt solution (Invitrogen) or 55 μm rapamycin (Calbiochem) treatments. Fluorescence was observed using a fluorescence microscope Nikon Eclypse 200 (Plan100×), an inverted fluorescence microscopy Olympus GX71, a confocal microscope Nikon Eclipse C1 (Plan40×/0.95 and Plan60×/1.40), or an inverted confocal microscope Olympus FV1000 (PLAPO N/1.42). Transmission Electron Microscopy—Cells were fixed without being brought into suspension and processed for transmission electron microscopy by standard procedures. Grids were examined under a Carl Zeiss C-10 electron microscope (Laboratorio Nacional de Investigación y Servicios en Microscopía Electrónica, University of Buenos Aires). Percentage of RFP-LC3 Cells with Punctate Staining—The number of cells with punctate staining per 100 fluorescent RFP-LC3 transfected cells was determined in three independent experiments. To quantify, the number of fluorescent cells with punctate staining was counted in six random fields representing 100 fluorescent cells and expressed as the mean ± S.D. of combined results. We consider an RFP-LC3 cell to have punctate staining when all the red fluorescence is present as punctate and no diffused protein remains. Recombinant GST-VMP1 Peptides and His6-Beclin 1 Protein—VMP1 hydrophilic peptides were amplified from pcDNA4-VMP1 by PCR and subcloned into pGEX-5X-2 (Amersham Biosciences) to obtain GST-VMP1 peptides. Peptides were expressed in Escherichia coli BL21 and purified by glutathione affinity chromatography (Amersham Biosciences). Beclin 1 cDNA was obtained from HeLa cell total RNA extracts and cloned into pQE31 (Qiagen). His6-Beclin 1 was expressed in E. coli M15 and purified using nickel-nitrilotriacetic acid-agarose beads (Qiagen). Membrane Isolation—Cells were washed and homogenized with a motor driven Teflon pestle homogenizer in ice-cold SBE buffer (250 mm sucrose, 1 mm EGTA, 10 mm Hepes/KOH, pH 7.5) containing protease inhibitors. Homogenates were centrifuged twice at 500 × g for 15 min. The resulting supernatants were centrifuged at 100,000 × g for 1 h. Membrane pellets were resuspended in ice-cold SBE buffer and treated with 1% Nonidet P-40 (Nonidet P-40), 0.2 m Na2CO3, pH 11.0, or 1.5 m NaCl. All steps were performed at 4 °C. The membrane pellets were obtained by centrifugation, and retained proteins were separated by SDS-PAGE. Western blot analysis was performed using as secondary antibody a peroxidase-labeled IgG antibody provided with the ECL-kit (Amersham Biosciences). Immunoblotting was performed using the ECL kit and membranes were exposed to a Kodak BioMax film. Pulldown Assays—HeLa cells transfected with the pcDNA4-VMP1, pcDNA4-VMP1ΔAtg, and pcDNA4-empty plasmids were lysed by sonication and solubilized with 1% Triton X-100, followed by a 30-min centrifugation at 100,000 × g. The supernatants containing His-tagged proteins were incubated with nickel-nitrilotriacetic acid-agarose beads (Qiagen) for 2 h at 4 °C, extensively washed with a buffer containing 5 mm imidazole, and eluted with a buffer containing 120 mm imidazole. Proteins were separated by SDS-PAGE and transferred to nitrocellulose for immunoblotting. In another experiment His6-Beclin 1 produced in E. coli was incubated in nickel-nitrilotriacetic acid-agarose beads with the purified GST-VMP1 peptides. Co-immunoprecipitation Assays—For the co-immunoprecipitation assays, the supernatant from lysates of pcDNA4-VMP1-transfected or rapamycin-treated cells were incubated with antisera bound to protein A-Sepharose™ Cl-4B beads (Amersham Biosciences) for 2 h at 4 °C and washed extensively. Bound proteins were eluted with 100 mm glycine-HCl, pH 2.5, precipitated by 5% trichloroacetic acid, washed with ice-cold acetone, and resuspended in a SDS sample buffer. Antibodies—Polyclonal rabbit antiserum to VMP1 against the peptide MAQSYAKRIQQRLNSEEKTK (residues 386-406) was obtained and used at 1:100 dilution. Polyclonal goat anti-LC3, goat anti-Beclin 1, rabbit anti-GST, monoclonal mouse anti-GFP (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), monoclonal mouse anti-V5 (Invitrogen) antibodies were used according manufacturer. Donkey anti-rabbit and anti-goat Alexa Fluor 488 and 590, and rabbit anti-mouse Alexa Fluor 590 (Molecular Probes) antibodies were used for immunofluorescence. Peroxidase-labeled anti-rabbit, anti-mouse, and anti-goat IgG antibodies were used for Western blot according Amersham Biosciences. Caerulein-induced Pancreatitis—Male Wistar rats weighing 200-250 g were used. Animals were housed with free access to food and water. Experiments were performed according to the standard ethical and legal guidelines of the Administración Nacional de Medicamentos, Alimentos y Tecnología Medica, University of Buenos Aires, and the European Union regulations for animal experiments. Pancreatitis was induced by seven intraperitoneal injections of caerulein (Sigma, 50 μg/kg) given at 1-h intervals; the rats were killed by decapitation at different times after the first injection. In one series of experiments, the pancreas were removed, homogenized in HEPES buffer, pH 7.4, containing protease inhibitors (0.5 mm phenylmethylsulfonyl fluoride, 5 μg/ml pepstatin, 5 μg/ml leupeptin, and 2.5 μg/ml aprotinin) and processed for Western blot analysis. In another series of experiments, the pancreas were removed, fixed in formalin buffer, and processed for immunofluorescence. Transgenic Mice—The transgene cassette was made using the pBEG vector (25Fernandez-Zapico M.E. Mladek A. Ellenrieder V. Folch-Puy E. Millar L. Urrutia R. EMBO J. 2003; 22: 4748-4758Crossref PubMed Scopus (86) Google Scholar). The expression cassette contains the acinar-specific control region (-500 to +8) from the rat elastase I gene and the human growth hormone 3′-untranslated region (+500 to +2657). This construct was digested with BamHI, filled in, dephosphorylated, and ligated with rat VMP1-EGFP released from pEGFP-VMP1 plasmid. A 1940-kb HindIII/NotI fragment was isolated and used for microinjections into in-bred Friend virus B-type susceptibility zygotes. Genomic DNA was prepared and tested by Southern blot or PCR. VMP1 Expression Triggers Autophagy—To know if VMP1 triggers autophagy, we transfected HeLa cells with the expression plasmid pcDNA4-VMP1, which codes for the VMP1-V5 fusion protein. The pcDNA4-empty plasmid was used in controls. Cells were cultured in nutrient and grown factor-replete conditions and fixed in glutaraldehyde 24 h later to perform transmission electronic microscopy. We found that cells expressing VMP1 showed multiple autophagic features. Fig. 1A shows cup-shaped structures, double-membrane structures containing cytoplasmic material (autophagosome like structure), as well as single-membrane structures containing cytoplasmic constituents at different stages of degradation (autolysosome-like structure) (26Gozuacik D. Kimchi A. Oncogene. 2004; 23: 2891-2906Crossref PubMed Scopus (1254) Google Scholar, 27Klionsky D.J. Nature. 2004; 431: 31-32Crossref PubMed Scopus (79) Google Scholar). The same morphological features were obtained when 293T cells were transfected with the VMP1-expression plasmid, and they did not differ from those obtained in rapamycin-treated cells (data not shown). During autophagy, the cytosolic form of LC3 (LC3-I) undergoes C-terminal proteolytic and lipid modifications (LC3-II) and translocates from the cytosol to the autophagosomal membrane (28Kabeya Y. Mizushima N. Ueno T. Yamamoto A. Kirisako T. Noda T. Kominami E. Ohsumi Y. Yoshimori T. EMBO J. 2000; 19: 5720-5728Crossref PubMed Scopus (5433) Google Scholar, 29Mizushima N. Yamamoto A. Matsui M. Yoshimori T. Ohsumi Y. Mol. Biol. Cell. 2004; 15: 1101-1111Crossref PubMed Scopus (1923) Google Scholar). LC3 is currently used as a specific marker of autophagy (30Yoshimori T. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004; 313: 453-458Crossref PubMed Scopus (462) Google Scholar, 31Klionsky D.J. Cuervo A.M. Seglen P.O. Autophagy. 2007; 3: 181-206Crossref PubMed Scopus (557) Google Scholar). To confirm the extent and specificity of VMP1 autophagosome induction, we first immunostained pcDNA4-VMP1-transfected 293T cells with a specific LC3 antibody, and we observed the recruitment of endogenous LC3 in punctate structures consistent with autophagy (Fig. 1B). Then, we investigated LC3-I and -II forms by Western blot (Fig. 1C). We found induction of LC3 with increased LC3-II form signal in pcDNA4-VMP1-transfected cells (Fig. 1C, lane 1). Because intra-autophagosomal LC3-II is degraded by lysosomal proteases, we blocked its proteolysis using the lysosomal protease inhibitor E64d (32Tanida I. Minematsu-Ikeguchi N. Ueno T. Kominami E. Autophagy. 2005; 1: 84-91Crossref PubMed Scopus (936) Google Scholar), and we found that LC3-II signal was enhanced in VMP1-expressing cells (Fig. 1C, lane 4). In another series of experiments HeLa, 293T, and NIH3T3 cells cultured under nutrient and grown factor-replete conditions were concomitantly transfected with an expression plasmid encoding for the RFP-LC3 fusion protein and pcDNA4-VMP1 or pcDNA4-empty plasmids. Fig. 1D shows the recruitment of LC3 fusion protein in punctate structures in VMP1-transfected cells in contrast to the diffuse RFP-LC3 fusion protein signal observed in control cells. We determine the percentage of fluorescent RFP-LC3 cells with punctate staining in three independent experiments per cell line as under "Experimental Procedures." We found high recruitment of LC3 in VMP1-transfected cells. Finally, we investigated the potential for inhibiting the pathway with an agent well documented to inhibit autophagy. The progression of the autophagy is sensitive to the PI3K inhibitors such as 3-MA, with the target being the Class III PI3K (33Petiot A. Ogier-Denis E. Blommaart E.F. Meijer A.J. Codogno P. J. Biol. Chem. 2000; 275: 992-998Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1032) Google Scholar). We treated cells with 3-MA before the co-transfection with pRFP-LC3 and pcDNA4-VMP1 expression plasmids, and we found that the percentage of RFP-LC3 cells with punctate staining was low and almost the same as the observed in pcDNA4-empty transfected cells (Fig. 1D). These results collectively demonstrate that VMP1 expression triggers autophagy in mammalian cells, even under nutrient-replete conditions. VMP1 Expression Is Required for Extracellular Stimuli-induced Autophagy—The autophagy trafficking pathway was first described as a cellular adaptation to starvation (34Mitchener J.S. Shelburne J.D. Bradford W.D. Hawkins H.K. Am. J. Pathol. 1976; 83: 485-491PubMed Google Scholar). To investigate whether starvation activates endogenous VMP1 expression, we developed a rabbit polyclonal anti-VMP1 antibody. We subjected HeLa cells to a standard starvation protocol (amino acid/serum-deprived medium) and then analyzed the time course of VMP1-mRNA expression by reverse transcription-PCR (Fig. 2A) and of VMP1-protein expression by Western blot (Fig. 2B). VMP1 expression was activated under starvation, and it was evident after 2-h treatment. Moreover, starvation-induced VMP1 expression was detected in punctate structures by immunofluorescence, whereas it was almost not detectable under nutrient-replete conditions (Fig. 2C). mTOR kinase plays a central role in the amino acid pool-sensing mechanism. In response to starvation, mTOR is inhibited, resulting in the induction of autophagy (35Jacinto E. Hall M.N. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2003; 4: 117-126Crossref PubMed Scopus (513) Google Scholar). Because mTOR can be inhibited by rapamycin, we treated HeLa cells with rapamycin as a pharmacological agent to induce autophagy. We found that mTOR inhibition induces VMP1-mRNA and VMP1-protein expression (Fig. 2, A-C). To establish whether VMP1 is required for autophagy, we reduced the expression of VMP1 using the small interfering RNA (siRNA) strategy. HeLa cells were transfected with VMP1-siRNA and then subjected to standard starvation protocol or rapamycin treatment. VMP1 expression was efficiently knocked down (Fig. 2, D and E). We found that autophagosome formation was almost completely inhibited in VMP1-siRNA cells under both treatments, as evidenced by the distribution of the RFP-LC3 fluorescence fusion protein (Fig. 2F). We analyzed three independent experiments per treatment, and we found that the percentage of RFP-LC3 cells with punctate staining in VMP1-siRNA transfected cells was highly reduced in comparison with those transfected with scramble siRNA (Fig. 2F). These findings show that VMP1 expression is required for extracellular stimuli-induced autophagy. VMP1 Remains as a Membrane Protein during Autophagy—VMP1 primary structure predicts a transmembrane protein (22Dusetti N.J. Jiang Y. Vaccaro M.I. Tomasini R. Samir Azizi A. Calvo E.L. Ropolo A. Fiedler F. Mallo G.V. Dagorn J.C. Iovanna J.L. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002; 290: 641-649Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar). GFP moiety folds properly and becomes fluorescent only if a membrane protein is stably inserted into the membrane (36Wagner S. Bader M.L. Drew D. de Gier J.W. Trends Biotechnol. 2006; 24: 364-371Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (211) Google Scholar). To verify if VMP1 remains in membrane structure we transfected cells with pEGFP-VMP1 expression plasmid, and cells were cultured in nutrient and grown factor-replete conditions. After 24 h the GFP fluorescence of the fusion protein VMP1-EGFP was observed in vacuole membranes induced by its own expression (Fig. 3A). We then analyzed whether VMP1 co-localizes with endogenous LC3 in the VMP1-induced vacuoles. We performed immunofluorescence using the anti-LC3 and anti-V5 antibodies in HeLa cells transfected with VMP1-V5 expression plasmid. We found a remarkable co-localization between VMP1-V5 fusion protein and endogenous LC3 in VMP1-induced vacuoles (Fig. 3B). To know if the endogenous VMP1 also remains as a membrane protein during autophagy, we performed subcellular fractioning of HeLa cells undergoing rapamycin-induced autophagy and investigated VMP1 in membrane preparations by Western blot. Fig. 3C shows that, although the protein is not detectable in untreated cells, VMP1 is found in the membrane preparations from cells undergoing autophagy, and the signal persists when membrane fractions are treated with 1.5 m NaCl or exposed to pH 11.0. These results indicate that VMP1 functions as a membrane protein during autophagy. VMP1 Is a Beclin 1-binding Protein—To obtain a mechanistic insight as to how VMP1 triggers autophagy, we analyzed its function in the molecular pathway of the autophagosome formation. During autophagy Beclin 1-Class III PI3K complex (37Kihara A. Kabeya Y. Ohsumi Y. Yoshimori T. EMBO Rep. 2001; 2: 330-335Crossref PubMed Scopus (724) Google Scholar) is thought to undergo subcellular distribution to a membrane structure, which eventually leads to the recruitment of autophagy proteins and the proper conjugation of LC3 to membrane phospholipids (19Kihara A. Noda T. Ishihara N. Ohsumi Y. J. Cell Biol. 2001; 152: 519-530Crossref PubMed Scopus (804) Google Scholar, 38Mizushima N. Yamamoto A. Hatano M. Koboyashi Y. Kabeya Y. Suzuki K. Tokuhisa T. Ohsumi Y. Yoshimori T. J. Cell Biol. 2001; 152: 657-668Crossref PubMed Scopus (1158) Google Scholar). However, the transmembrane protein with which Beclin 1 complex interacts remains elusive. To investigate if VMP1 is a target membrane protein with which Beclin 1 interacts, we first analyzed if Beclin 1 localizes in the membrane of the VMP1-induced vacuoles. We concomitantly transfected 293T cells with pEGFP-VMP1, pRFP-LC3, and pECFP-Beclin 1 expression plasmids (results are shown in Fig. 4A). We found a remarkable co-localization between VMP1, LC3, and Beclin 1 fluorescent fusion proteins, suggesting that Beclin 1 could attach to VMP1-induced vacuole membranes. Then, we studied if VMP1 interacts with Beclin 1. We performed a pulldown assay using the VMP1-V5-His6 fusion protein. Lysates prepared from HeLa cells transfected with pcDNA4-VMP1 were treated with Triton X-100 and incubated with nickel-agarose beads. After extensively washed, retained proteins were eluted with imidazole and separated by SDS-PAGE followed by anti-Beclin 1 or anti-V5 antibody immunoblotting. VMP1-V5 and Beclin 1 were found in eluates (Fig. 4B). Control experiments showed that neither Beclin 1 nor VMP1-V5 was detected in the elution fraction of pcDNA4-empty-transfected cells. In another series of experiments, lysates from pcDNA4-VMP1-transfected cells were incubated with the anti-Beclin 1 antibody. Controls were incubated with control serum. Immunoprecipitates were separated and immunoblotted for VMP1-V5 with anti-V5 antibody. VMP1-V5 was detected in Beclin 1 antibody-treated lysates but not in the controls (Fig. 4C). To analyze the physiological relevance of the VMP1-Beclin 1 interaction, we investigated whether endogenous VMP1 interacts with endogenous Beclin 1 in cells developing rapamycin-induced autophagy by co-immunoprecipitation experiments. Endogenous Beclin 1 an

البلعمة الذاتية هي عملية تحلل للمكونات الخلوية السيتوبلازمية، والتي تعمل كآلية بقاء في الخلايا الجائعة، وتتميز بعزل السيتوبلازما السائبة والعضيات في حويصلات الغشاء المزدوج تسمى البلعمة الذاتية. تم ربط البلعمة الذاتية بمجموعة متنوعة من العمليات المرضية مثل الأمراض التنكسية العصبية وتكوين الأورام، مما يسلط الضوء على أهميتها البيولوجية والطبية. لقد وصفنا سابقًا جين البروتين الغشائي للفجوة 1 (VMP1)، والذي يتم تنشيطه بشكل كبير في التهاب البنكرياس الحاد، وهو مرض مرتبط بالتغيرات المورفولوجية التي تشبه البلعمة الذاتية. هنا نوضح أن تعبير VMP1 يؤدي إلى الالتهام الذاتي في خلايا الثدييات. يحث تعبير VMP1 على تكوين السمات البنيوية الفائقة للالتهام الذاتي وتجنيد البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة 1 السلسلة الخفيفة 3 (LC3)، والتي يتم تثبيطها بعد العلاج بمثبط الالتهام الذاتي 3 - ميثيل أدينين. يتم تحفيز VMP1 عن طريق التجويع وعلاجات الراباميسين. تعبيره ضروري للبلعمة الذاتية، لأن الحمض النووي الريبوزي المتداخل الصغير VMP1 يمنع تكوين البلعمة الذاتية تحت كل من محفزات البلعمة الذاتية. VMP1 هو بروتين عبر الغشاء يتواجد بشكل مشترك مع LC3، وهو علامة على البلعوم الذاتي. يتفاعل مع Beclin 1، وهو بادئ البلعمة الذاتية للثدييات، من خلال مجال VMP1 - Atg، وهو أمر ضروري لتشكيل البلعمة الذاتية. يتواجد التعبير الداخلي VMP1 مع LC3 في أنسجة البنكرياس التي تخضع للبلعمة الذاتية الناجمة عن التهاب البنكرياس. وأخيرًا، فإن التعبير المستقر VMP1 الذي يستهدف خلية البنكرياس العنبية في الفئران المعدلة وراثيًا يحفز تكوين البلعمة الذاتية. تحدد نتائجنا VMP1 كبروتين غشائي جديد مرتبط بالبلعمة الذاتية يشارك في الخطوات الأولية لعملية البلعمة الذاتية للخلية الثديية. البلعمة الذاتية هي عملية تحلل للمكونات الخلوية السيتوبلازمية، والتي تعمل كآلية بقاء في الخلايا الجائعة، وتتميز بعزل السيتوبلازما السائبة والعضيات في حويصلات الغشاء المزدوج تسمى البلعمة الذاتية. تم ربط البلعمة الذاتية بمجموعة متنوعة من العمليات المرضية مثل الأمراض التنكسية العصبية وتكوين الأورام، مما يسلط الضوء على أهميتها البيولوجية والطبية. لقد وصفنا سابقًا جين البروتين الغشائي للفجوة 1 (VMP1)، والذي يتم تنشيطه بشكل كبير في التهاب البنكرياس الحاد، وهو مرض مرتبط بالتغيرات المورفولوجية التي تشبه البلعمة الذاتية. هنا نوضح أن تعبير VMP1 يؤدي إلى الالتهام الذاتي في خلايا الثدييات. يحث تعبير VMP1 على تكوين السمات البنيوية الفائقة للالتهام الذاتي وتجنيد البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة 1 السلسلة الخفيفة 3 (LC3)، والتي يتم تثبيطها بعد العلاج بمثبط الالتهام الذاتي 3 - ميثيل أدينين. يتم تحفيز VMP1 عن طريق التجويع وعلاجات الراباميسين. تعبيره ضروري للبلعمة الذاتية، لأن الحمض النووي الريبوزي المتداخل الصغير VMP1 يمنع تكوين البلعمة الذاتية تحت كل من محفزات البلعمة الذاتية. VMP1 هو بروتين عبر الغشاء يتواجد بشكل مشترك مع LC3، وهو علامة على البلعوم الذاتي. يتفاعل مع Beclin 1، وهو بادئ البلعمة الذاتية للثدييات، من خلال مجال VMP1 - Atg، وهو أمر ضروري لتشكيل البلعمة الذاتية. يتواجد التعبير الداخلي VMP1 مع LC3 في أنسجة البنكرياس التي تخضع للبلعمة الذاتية الناجمة عن التهاب البنكرياس. وأخيرًا، فإن التعبير المستقر VMP1 الذي يستهدف خلية البنكرياس العنبية في الفئران المعدلة وراثيًا يحفز تكوين البلعمة الذاتية. تحدد نتائجنا VMP1 كبروتين غشائي جديد مرتبط بالبلعمة الذاتية يشارك في الخطوات الأولية لعملية البلعمة الذاتية للخلية الثديية. الالتهام الذاتي هو عملية تحلل محفوظة تطوريًا للمكونات الخلوية السيتوبلازمية، والتي تعمل كآلية بقاء في الخلايا الجائعة (1Codogno P. Meijer A.J. Cell Death Differ. 2005 ؛ 12: 1509-1518 كروسريف بوبمد سكوبس (946) الباحث العلمي من جوجل، 2 كرومر ج. جايا تيلا م. نات. Rev. Cancer. 2005; 5: 886-897 Crossref PubMed Scopus (1037) Google Scholar, 3Levine B. Klionsky D.J. Dev. الخلية. 2004 ؛ 6: 463-477 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (3189) الباحث العلمي من Google). تشارك هذه العملية التقويضية في دوران البروتينات طويلة العمر والجزيئات الكبيرة الخلوية الأخرى، وقد تلعب دورًا وقائيًا في التطور والشيخوخة وموت الخلايا والدفاع ضد مسببات الأمراض داخل الخلايا (4Hara T. Nakamura K. Matsui M. Yamamoto A. Nakahara Y. Suzuki - Migishima R. Yokoyama M. Mishima K. Saito I. Okano H. Mizushima N. Nature. 2006 ؛ 441: 885-889 Crossref PubMed Scopus (3108) Google Scholar، 5Komatsu M. Ueno T. Waguri S. Uchiyama Y. Kominami E. Tanaka K. Cell Death Differ. 2007 ؛ 14: 887-894 Crossref PubMed Scopus (136) Google Scholar، 6Levine B. Cell. 2005 ؛ 120: 159-162 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (690) الباحث العلمي من Google، 7Lum J.J. Bauer D.E. Kong M. Harris M.H. Li C. Lindsten T. Thompson C.B. Cell. 2005 ؛ 120: 237-248 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (1263) الباحث العلمي من Google، 8Qu X. Zou Z. Sun Q. Luby - Philps K. Cheng P. Hogan R. Gilpin C. Levine B. Cell. 2007 ؛ 128: 931-946 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (523) الباحث العلمي من Google). من خلال الدراسات المورفولوجية، تم ربط البلعمة الذاتية بمجموعة متنوعة من العمليات المرضية مثل الأمراض التنكسية العصبية وتكوين الأورام، مما يسلط الضوء على أهميتها البيولوجية والطبية (4Hara T. Nakamura K. Matsui M. Yamamoto A. Nakahara Y. Suzuki - Migishima R. Yokoyama M. Mishima K. Saito I. Okano H. Mizushima N. Nature. 2006; 441: 885-889 Crossref PubMed Scopus (3108) Google Scholar, 9Pattingre S. Levine B. Cancer Res. 2006; 66: 2885-2888 Crossref PubMed Scopus (252) Google Scholar, 10Shintani T. Klionsky D.J. Science. 2004 ؛ 306: 990-995 Crossref PubMed Scopus (2163) الباحث العلمي من Google). تشمل التقارير المبكرة عن الالتهام الذاتي في الأمراض البشرية ميزات الالتهام الذاتي فائقة البنية الموصوفة في البنكرياس من التهاب البنكرياس البشري (11Helin H. Mero M. Markkula H. Helin M. Virchows Arch. A Pathol. Anat. Histol. 1980 ؛ 387: 259-270 كروسريف بوبميد سكوبس (63) الباحث العلمي من جوجل، 12 ويلمر س. كلوبيل ج. كيرن إتش إف. أدلر ج. فيرشوز آرتش. A Pathol. Anat. Histopathol. 1989 ؛ 415: 115-123 Crossref PubMed Scopus (46) الباحث العلمي من Google). يتميز البلعمة الذاتية بعزل السيتوبلازم والعضيات السائبة في حويصلات مزدوجة الغشاء تسمى البلعمة الذاتية، والتي تكتسب في النهاية ميزات تشبه الليزوزومات (13 ميزوشيما ن. موت الخلية يختلف. 2005 ؛ 12: 1535-1541 Crossref PubMed Scopus (404) Google Scholar، 14Klionsky D.L. Emr S.D. Science. 2000 ؛ 290: 1717-1721 Crossref PubMed Scopus (2969) الباحث العلمي من Google). يتم التوسط في الالتهام الذاتي من خلال مجموعة من منتجات الجينات المحفوظة تطوريًا (تسمى بروتينات ATG) التي تم اكتشافها في الأصل في الخميرة (15Klionsky D.J. Cregg J.M. Dunn Jr., W.A. Emr S.D. Sakai Y. Sandoval I.V. Sibirny A. Subramani S. Thumm M. Veenhuis M. Ohsumi Y. Dev. الخلية. 2003 ؛ 5: 539-545 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (1016) الباحث العلمي من Google). في خلايا الثدييات، Beclin 1 (3Levine B. Klionsky D.J. Dev. الخلية. 2004 ؛ 6: 463-477 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (3189) الباحث العلمي من Google، 16Liang XH Jackson S. Seaman M. Brown K. Kempkes B. Hibshoosh H. Levine B. Nature. 1999 ؛ 402: 672-676 Crossref PubMed Scopus (2737) Google Scholar، 17Liang C. Feng P. Ku B. Dotan I. Canaani D. Oh BH Jung JU Nat. Cell Biol. 2006; 8: 688-699 Crossref PubMed Scopus (841) Google Scholar, 18Pattingre S. Tassa A. Qu X. Garuti R. Liang X.H. Mizushima N. Packer M. Schneider M. D. Levine B. Cell. 2005 ؛ 122: 927-939 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (2931) الباحث العلمي من Google) يعزز تكوين البلعمة الذاتية عندما يعمل كجزء من مركب مع الفئة الثالثة من فوسفاتيديلينوسيتول 3 -كيناز (PI3K) 6 الاختصارات المستخدمة هي: PI3Kphosphatidylinositol 3 -كيناز VMP1vacuole بروتين غشائي 1LC3 ضوء سلسلة 3siRNA الصغيرة المتداخلة RNA3 - MA3 - methyladenineGSTglutathione S - transferaseGFPgreen fluorescent proteinmTORmalian target of rapamycinAtgautophagy related domainRFPred fluorescent protein. 6 الاختصارات المستخدمة هي: PI3Kphosphatidylinositol 3 - kinase VMP1vacuole membrane protein 1LC3 light - chain 3siRNAsmall intervering RNA3 - MA3 - methyladenineGSTglutathione S - transferaseGFPgreen fluorescent proteinmTORmammalian target of rapamycinAtgautophagy - related domainRFPred fluorescent protein. mediating the localization of other autophagic proteins to the autophagosomal membrane (19Kihara A. Noda T. Ishihara N. Ohsumi YJ Cell Biol. 2001 ؛ 152: 519-530 Crossref PubMed Scopus (804) الباحث العلمي من Google). ومع ذلك، على الرغم من التقدم في فهم البلعمة الذاتية، فإن تكوين البلعمة الذاتية في خلايا الثدييات هو عملية معقدة، ولا يتم توضيح الآليات الجزيئية ولا جميع الجينات المتورطة في تكوينها بشكل كامل (20Juhasz G. Neufeld T.P. PLoS Biol. 2006 ؛ 4: e36Crossref PubMed Scopus (122) Google Scholar، 21Klionsky D.J. Cell Sci. 2005; 118: 7-18 Crossref PubMed Scopus (766) Google Scholar). phosphatidylinositol 3 - kinase vacuole membrane protein 1 light - chain 3 small intervering RNA 3 - methyladenine glutathione S - transferase green fluorescent protein mammalian target of rapamycin autophagy domain red fluorescent protein. phosphatidylinositol 3 -kinase vacuole membrane protein 1 light - chain 3 small intervering RNA 3 - methyladenine glutathione S - transferase green fluorescent protein mammalian target of rapamycin autophagy domain red fluorescent protein. البروتين المرتبط بالتهاب البنكرياس المسمى بروتين غشاء الفجوة 1 (VMP1) هو بروتين عبر الغشاء مع عدم وجود متجانسات معروفة في الخميرة. حددنا نسخة VMP1 لأنها نشطة للغاية في الخلايا العنبية في وقت مبكر أثناء التهاب البنكرياس الحاد التجريبي وتسبب تعبيره العابر في تكوين العديد من الفجوات السيتوبلازمية في خلايا الثدييات (22Dusetti NJ Jiang Y. Vaccaro MI Tomasini R. Samir Azizi A. Calvo EL Ropolo A. Fiedler F. Mallo GV Dagorn JC Iovanna JL Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002; 290: 641-649 Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar). يرتبط VMP1 mRNA في التعبير الموضعي بتكوين فجوات في الخلايا العنبية أثناء التهاب البنكرياس الحاد التجريبي وفي سياق التهاب البنكرياس المزمن في فئران WBN/KOB (23Vaccaro M.I. Grasso D. Ropolo A. Iovanna J.L. Cerquetti M.C. Pancreatology. 2003 ؛ 3: 69-74 Crossref PubMed Scopus (34) Google Scholar، 24Jiang P.H. Motoo Y. Vaccaro M.I. Iovanna J.L. Okada G. Sawabu N. Pancreas. 2004 ؛ 29: 225-230 Crossref PubMed Scopus (17) الباحث العلمي من Google). في هذه الدراسة، اختبرنا الفرضية القائلة بأن تعبير VMP1 متورط في عملية الالتهام الذاتي. نظهر أن VMP1 هو بروتين غشائي جديد مرتبط بالبلعمة الذاتية يحفز تكوين البلعمة الذاتية في خلايا الثدييات. يتم تحفيز VMP1 بواسطة محفزات البلعمة الذاتية ؛ وهو مطلوب لتطور البلعمة الذاتية ويؤدي تعبيره إلى البلعمة الذاتية، حتى في ظل ظروف اكتمال المغذيات. يتفاعل VMP1 مع Beclin 1 من خلال منطقة الطرف C المحبة للماء، والتي أطلقنا عليها اسم مجال ATG لأنه ضروري لتشكيل البلعمة الذاتية. نظهر أيضًا أن VMP1 يتواجد مع البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة 1 السلسلة الخفيفة 3 (LC3) في أغشية الفجوة في أنسجة البنكرياس التي تخضع للبلعمة الذاتية الناجمة عن التهاب البنكرياس. أخيرًا، وجدنا أن تعبير VMP1 يعزز تكوين فجوات إيجابية LC3 عندما يستهدف على وجه التحديد خلايا البنكرياس العنبية في الفئران المعدلة وراثيًا. تم استخدام خطوط خلايا الثدييات، والعدوى، والعلاجات - هيلا البشرية، 293T و MCF7، وسلالات خلايا الماوس NIH3T3 (ATCC). تم التحقق من مستويات منخفضة من بيكلين 1 في خلايا MCF7 بواسطة لطخة غربية. تم نقل الخلايا باستخدام كاشف FuGENE -6 (Roche Applied Science). كانت البلازميدات عبارة عن pcDNA4 - V5 - His (Invitrogen) و pEGFP - N1 (Clontech)، تحتوي على فئران كاملة الطول VMP1 cDNA (NM _138839) (22Dusetti NJ Jiang Y. Vaccaro M.I. Tomasini R. Samir Azizi A. Calvo E.L. Ropolo A. Fiedler F. Mallo G.V. Dagorn J.C. Iovanna J.L. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002; 290: 641-649 Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar) أو VMP1ΔAtg المستنسخة فرعيًا داخل موقعي تقييد HindIII و BamHI. تم استنساخ بيكلين البشري كامل الطول 1 cDNA (NM _003766) في pECFP - C1 (Clontech) داخل EcoRI و SALI أو في pcDNA3 (Invitrogen) داخل مواقع تقييد EcoRI و ApaI. تم توفير pRFP - C1 الذي يحتوي على الفئران كاملة الطول LC3 من قبل الدكتورة ماريا إ. كولومبو (الجامعة الوطنية في كويو، المجلس الوطني للبحوث العلمية والتقنية (CONICET)، الأرجنتين). كما تم نقل الخلايا باستخدام نقل Oligofectamine (Invitrogen)بوساطة siRNA المصمم مسبقًا للحمض النووي الريبوزي المرسال VMP1 البشري باستخدام 5 ′- GGCAGAAUUUUGUGUGtt -3 ′، SENSE، و 5 ′- CACAGGACAAUAUUUCUGCCtt -3 ′، كمضاد للحس (Ambion ID32935) وبعد 24 ساعة، تعرضت الخلايا لمحفزات الالتهام الذاتي لفترة 6 ساعات إضافية. لتثبيط البلعمة الذاتية، تمت معالجة الخلايا بـ 10 مم 3 - ميثيل أدينين (3 مللي أمبير) (سيجما) 2 ساعة قبل وأثناء العدوى المشتركة بـ pcDNA4 - VMP1 و pRFP - LC3. تم التحقق من فعالية علاج 3 - MA على الخلايا المتعطشة (لم يتم عرض البيانات). لتثبيط إنزيم الهيدرولاز الليزوزومي، تمت معالجة الخلايا باستخدام E64d (10 ميكروغرام/مل) لمدة 4 ساعات قبل معالجتها. تم تحفيز الالتهام الذاتي عن طريق الأحماض الأمينية/الوسط المحروم من المصل باستخدام محلول إيرل الملحي المتوازن (Invitrogen) أو 55 ميكرومتر من علاجات الراباميسين (Calbiochem). لوحظ التألق باستخدام مجهر التألق Nikon Eclypse 200 (Plan100 ×)، أو مجهر التألق المقلوب Olympus GX71، أو مجهر متحد البؤر Nikon Eclipse C1 (Plan40×/0.95 و Plan60×/1.40)، أو مجهر متحد البؤر مقلوب Olympus FV1000 (PLAPO N/1.42). تم تثبيت خلايا المجهر الإلكتروني للإرسال دون تعليقها ومعالجتها للفحص المجهري الإلكتروني للإرسال من خلال الإجراءات القياسية. تم فحص الشبكات تحت المجهر الإلكتروني Carl Zeiss C -10 (Laboratorio Nacional deInvestigacion y Servicios en Microscopi? a Electro? nica، جامعة بوينس آيرس). النسبة المئوية لخلايا RFP - LC3 ذات التلطيخ المنقط - تم تحديد عدد الخلايا ذات التلطيخ المنقط لكل 100 خلية مصابة بالفلورسنت RFP - LC3 في ثلاث تجارب مستقلة. وللتحديد الكمي، تم حساب عدد الخلايا الفلورية ذات التلوين المرقط في ستة حقول عشوائية تمثل 100 خلية فلورية وتم التعبير عنها بمتوسط ± SD للنتائج المجمعة. نعتبر أن خلية RFP - LC3 بها تلطيخ منقط عندما يكون كل التألق الأحمر موجودًا كنقاط ولا يبقى بروتين منتشر. تم تضخيم ببتيدات GST - VMP1 المؤتلفة وببتيدات His6 - Beclin 1 الآلفة للماء بروتين VMP1 من pcDNA4 - VMP1 بواسطة PCR واستنساخها فرعيًا في pGEX -5X -2 (Amersham Biosciences) للحصول على ببتيدات GST - VMP1. تم التعبير عن الببتيدات في الإشريكية القولونية BL21 وتنقيتها بواسطة كروماتوغرافيا تقارب الجلوتاثيون (Amersham Biosciences). تم الحصول على Beclin 1 cDNA من مستخلصات الحمض النووي الريبي الكلي لخلية هيلا واستنساخها في pQE31 (Qiagen). تم التعبير عن His6 - Beclin 1 في E. coli M15 وتم تنقيته باستخدام خرزات حمض أجاروز النيكل والنتريلوتريسيتيك (Qiagen). تم غسل خلايا عزل الغشاء وتجانسها بمجانس مدقة تفلون مدفوعة بمحرك في منطقة عازلة SBE باردة مثلجة (سكروز 250 مم، 1 مم EGTA، 10 مم Hepes/KOH، درجة الحموضة 7.5) تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني. تم طرد المجانسات مرتين عند 500 × جم لمدة 15 دقيقة. تم طرد المواد الطافية الناتجة مركزيًا عند 100000 × جم لمدة ساعة واحدة. تم إعادة تعليق حبيبات الغشاء في المخزن المؤقت SBE البارد ومعالجتها بـ 1 ٪ Nonidet P -40 (Nonidet P -40)، 0.2 متر Na2CO3، الرقم الهيدروجيني 11.0، أو 1.5 متر NaCl. تم تنفيذ جميع الخطوات عند 4 درجات مئوية. تم الحصول على حبيبات الغشاء عن طريق الطرد المركزي، وتم فصل البروتينات المحتجزة بواسطة SDS - PAGE. تم إجراء تحليل البقعة الغربية باستخدام جسم مضاد ثانوي وهو جسم مضاد IgG مسمى بالبيروكسيداز مزود بمجموعة ECL (Amersham Biosciences). تم إجراء التخثر المناعي باستخدام مجموعة ECL وتعرضت الأغشية لفيلم Kodak BioMax. فحوصات السحب - تم تحليل خلايا HeLa المصابة بـ pcDNA4 - VMP1 و pcDNA4 - VMP1ΔAtg و pcDNA4 - البلازميدات الفارغة بواسطة صوتنة وذوبانها بنسبة 1 ٪ Triton X -100، متبوعة بالطرد المركزي لمدة 30 دقيقة عند 100000 × جم. تم تحضين المواد الطافية التي تحتوي على بروتينات موسومة بالنيكل والنيتريلوتريسيتيك وحمض أجاروز (Qiagen) لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية، وتم غسلها على نطاق واسع بمنطقة عازلة تحتوي على 5 مم إيميدازول، وتم تصفيتها بمنطقة عازلة تحتوي على 120 مم إيميدازول. تم فصل البروتينات بواسطة SDS - PAGE ونقلها إلى النيتروسليلوز للتقطيع المناعي. في تجربة أخرى، تم تحضين His6 - Beclin 1 المنتج في الإشريكية القولونية في خرزات حمض النيتريلوتريسيتيك- أجاروز مع ببتيدات GST - VMP1 المنقاة. فحوصات الترسيب المناعي المشترك - بالنسبة لفحوصات الترسيب المناعي المشترك، تم تحضين المادة الطافية من محللات خلايا pcDNA4 - VMP1 المنقولة أو المعالجة بالراباميسين مع مضادات مرتبطة بالبروتين A - Sepharose™ Cl -4B الخرز (Amersham Biosciences) لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية وغسلها على نطاق واسع. تمت إزالة البروتينات المرتبطة باستخدام 100 مم من جلايسين- HCl، ودرجة الحموضة 2.5، وترسيبها بواسطة 5 ٪ من حمض ثلاثي كلورو أسيتيك، وغسلها باستخدام الأسيتون المثلج، وإعادة تعليقها في مخزن مؤقت لعينة SDS. الأجسام المضادة - مصل الأرانب متعدد النسيلة المضاد لـ VMP1 ضد الببتيد MAQSYAKRIQRLNSEEKK (البقايا 386-406) تم الحصول عليها واستخدامها عند تخفيف 1:100. تم استخدام الماعز متعدد النسائل المضاد لـ LC3، والماعز المضاد للعشب 1، والأرنب المضاد لـ GST، والفأر أحادي النسيلة المضاد لـ GFP (Santa Cruz Biotechnology، Santa Cruz، CA)، والأجسام المضادة للفأر أحادي النسيلة المضاد لـ V5 (Invitrogen) وفقًا للشركة المصنعة. تم استخدام الأجسام المضادة للحمار المضاد للأرنب والماعز أليكسا فلور 488 و 590، والأجسام المضادة للأرنب المضاد للفأر أليكسا فلور 590 (المجسات الجزيئية) للتألق المناعي. تم استخدام الأجسام المضادة للغلوبولين المناعي G التي تحمل علامة البيروكسيداز المضادة للأرانب والفئران والماعز للبقع الغربية وفقًا لـ Amersham Biosciences. تم استخدام التهاب البنكرياس الناجم عن الكيرولين - ذكور فئران ويستار التي تزن 200-250 جرام. تم إيواء الحيوانات مع حرية الوصول إلى الغذاء والماء. تم إجراء التجارب وفقًا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية والقانونية القياسية للإدارة الوطنية للأدوية، والتغذية والتكنولوجيا الطبية، وجامعة بوينس آيرس، ولوائح الاتحاد الأوروبي للتجارب على الحيوانات. تم تحفيز التهاب البنكرياس عن طريق سبع حقن داخل الصفاق من السيرولين (سيجما، 50 ميكروغرام/كغ) تعطى على فترات ساعة واحدة ؛ تم قتل الفئران عن طريق قطع الرأس في أوقات مختلفة بعد الحقن الأول. في سلسلة واحدة من التجارب، تمت إزالة البنكرياس، المتجانسة في هيبس العازلة، ودرجة الحموضة 7.4، التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني (0.5 مم فينيل ميثيل سلفونيل فلوريد، 5 ميكروغرام/مل بيبستاتين، 5 ميكروغرام/مل ليوبيبتين، و 2.5 ميكروغرام/مل بروتينين) ومعالجتها لتحليل البقعة الغربية. في سلسلة أخرى من التجارب، تمت إزالة البنكرياس، وتثبيته في عازل الفورمالين، ومعالجته للتألق المناعي. الفئران المحورة وراثياً - تم صنع شريط الجينات المحورة باستخدام ناقل pBEG (25 فرنانديز- زابيكو M.E. Mladek A. Ellenrieder V. Folch - Puy E. Millar L. Urrutia R. EMBO J. 2003 ؛ 22: 4748-4758 Crossref PubMed Scopus (86) الباحث العلمي من Google). يحتوي كاسيت التعبير على منطقة التحكم الخاصة بالسينار (-500 إلى +8) من جين الفئران إيلاستاز I والمنطقة غير المترجمة لهرمون النمو البشري 3'(+500 إلى +2657). تم هضم هذا التركيب باستخدام BamHI، وملئه، وإزالة الفوسفور منه، وربطه ببلازميد VMP1 - EGFP للفئران الذي تم إطلاقه من بلازميد PEGFP - VMP1. تم عزل جزء HindIII/NotI بسعة 1940 كيلو بايت واستخدامه للحقن المجهرية في زيجوت الحساسية لفيروس Friend من النوع B. تم تحضير الحمض النووي الجيني واختباره بواسطة البقعة الجنوبية أو تفاعل البوليميراز المتسلسل. VMP1 Expression Triggers Autophagy - لمعرفة ما إذا كان VMP1 يؤدي إلى الالتهام الذاتي، قمنا بنقل خلايا هيلا مع التعبير plasmid pcDNA4 - VMP1، والذي يرمز لبروتين اندماج VMP1 - V5. تم استخدام البلازميد الفارغ pcDNA4 في عناصر التحكم. تمت زراعة الخلايا في ظروف المغذيات والعوامل الكاملة المزروعة وتم تثبيتها في الجلوتارالدهيد بعد 24 ساعة لإجراء الفحص المجهري الإلكتروني للإرسال. وجدنا أن الخلايا التي تعبر عن VMP1 أظهرت العديد من ميزات الالتهام الذاتي. يوضح الشكل 1 أ هياكل على شكل كوب، وهياكل مزدوجة الغشاء تحتوي على مادة سيتوبلازمية (بنية تشبه البلعمة الذاتية)، بالإضافة إلى هياكل أحادية الغشاء تحتوي على مكونات سيتوبلازمية في مراحل مختلفة من التدهور (بنية تشبه الحالة الذاتية) (26 Gozuacik D. Kimchi A. Oncogene. 2004 ؛ 23: 2891-2906 Crossref PubMed Scopus (1254) Google Scholar، 27Klionsky D.J. Nature. 2004 ؛ 431: 31-32 Crossref PubMed Scopus (79) الباحث العلمي من Google). تم الحصول على نفس السمات المورفولوجية عندما تم نقل خلايا 293T مع بلازميد تعبير VMP1، ولم تختلف عن تلك التي تم الحصول عليها في الخلايا المعالجة بالراباميسين (لم يتم عرض البيانات). أثناء البلعمة الذاتية، يخضع الشكل الخلوي لـ LC3 (LC3 - I) لتعديلات البروتين والدهون الطرفية C (LC3 - II) وينتقل من الحل الخلوي إلى غشاء البلعمة الذاتية (28Kabeya Y. Mizushima N. Ueno T. Yamamoto A. Kirisako T. Noda T. Kominami E. Ohsumi Y. Yoshimori T. EMBO J. 2000; 19: 5720-5728 Crossref PubMed Scopus (5433) Google Scholar, 29Mizushima N. Yamoto A. Matsui M. Yoshimori T. Ohsumi Y. Mol. Biol. Cell. 2004; 15: 1101-1111 Crossref PubMed Scopus (1923) Google Scholar). يستخدم LC3 حاليًا كعلامة محددة للبلعمة الذاتية (30 Yoshimori T. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2004; 313: 453-458 Crossref PubMed Scopus (462) Google Scholar, 31Klionsky D.J. Cuervo A.M. Seglen P.O. Autophagy. 2007 ؛ 3: 181-206 Crossref PubMed Scopus (557) الباحث العلمي من Google). لتأكيد مدى وخصوصية تحريض البلعمة الذاتية VMP1، قمنا أولاً بتحصين خلايا pcDNA4 - VMP1 المنقولة بالعدوى 293T مع جسم مضاد LC3 محدد، ولاحظنا تجنيد LC3 داخلي المنشأ في الهياكل المنقطية بما يتفق مع البلعمة الذاتية (الشكل. 1 ب). بعد ذلك، تحققنا من نماذج LC3 - I و - II بواسطة لطخة غربية (الشكل 1C). وجدنا تحريض LC3 مع زيادة إشارة شكل LC3 - II في الخلايا المصابة بـ pcDNA4 - VMP1 (الشكل 1C، حارة 1). نظرًا لأن LC3 - II داخل البلعمة الذاتية يتحلل بواسطة البروتياز الليزوزومي، فقد منعنا تحلل البروتين باستخدام مثبط البروتياز الليزوزومي E64d (32Tanida I. Minematsu - Ikeguchi N. Ueno T. Kominami E. Autophagy. 2005 ؛ 1: 84-91 Crossref PubMed Scopus (936) الباحث العلمي من Google)، ووجدنا أن إشارة LC3 - II قد تم تعزيزها في الخلايا المعبرة عن VMP1 (الشكل 1C، الحارة 4). في سلسلة أخرى من التجارب، تم نقل خلايا هيلا، 293T، و NIH3T3 المستزرعة تحت ظروف المغذيات والعوامل الكاملة المزروعة بشكل متزامن مع ترميز بلازميد تعبير لبروتين الانصهار RFP - LC3 والبلازميدات الفارغة pcDNA4 - VMP1 أو pcDNA4. يوضح الشكل 1 د تجنيد بروتين الانصهار LC3 في البنى المنقطية في الخلايا المنقولة عبر VMP1 على النقيض من إشارة بروتين الانصهار RFP - LC3 المنتشرة التي لوحظت في خلايا التحكم. نحدد النسبة المئوية لخلايا RFP - LC3 الفلورية مع تلطيخ نقطي في ثلاث تجارب مستقلة لكل خط خلية كما هو الحال في "الإجراءات التجريبية"." وجدنا تجنيدًا مرتفعًا لـ LC3 في الخلايا المصابة بـ VMP1. أخيرًا، بحثنا في إمكانية تثبيط المسار باستخدام عامل موثق جيدًا لتثبيط الالتهام الذاتي. تطور الالتهام الذاتي حساس لمثبطات PI3K مثل 3 - MA، مع الهدف هو الفئة الثالثة PI3K (33Petiot A. Ogier - Denis E. Blommaart E.F. Meijer A.J. Codogno P. J. Biol. كيم. 2000 ؛ 275: 992-998 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (1032) الباحث العلمي من Google). عالجنا الخلايا التي تحتوي على 3 مللي أمبير قبل العدوى المشتركة ببلازميدات التعبير pRFP - LC3 و pcDNA4 - VMP1، ووجدنا أن النسبة المئوية لخلايا RFP - LC3 ذات التلطيخ المرقط كانت منخفضة وتقريبًا نفس النسبة التي لوحظت في الخلايا المنقولة بالعدوى الفارغة من pcDNA4 (الشكل 1D). تظهر هذه النتائج بشكل جماعي أن تعبير VMP1 يؤدي إلى الالتهام الذاتي في خلايا الثدييات، حتى في ظل ظروف التغذية الكاملة. VMP1 التعبير مطلوب للالتهام الذاتي الناجم عن المحفزات خارج الخلية - تم وصف مسار الاتجار بالتهام الذات لأول مرة على أنه تكيف خلوي مع الجوع (34Mitchener JS Shelburne JD Bradford WD Hawkins H.K. Am. J. Pathol. 1976; 83: 485-491 PubMed Google Scholar). للتحقق مما إذا كان الجوع ينشط تعبير VMP1 الداخلي، قمنا بتطوير جسم مضاد متعدد النسائل للأرانب VMP1. أخضعنا خلايا هيلا لبروتوكول تجويع قياسي (وسط محروم من الأحماض الأمينية/المصل) ثم قمنا بتحليل المسار الزمني لتعبير VMP1 - mRNA عن طريق النسخ العكسي - PCR (الشكل 2A) والتعبير عن البروتين VMP1 بواسطة لطخة غربية (الشكل 2 ب). تم تنشيط تعبير VMP1 تحت الجوع، وكان واضحًا بعد العلاج لمدة ساعتين. علاوة على ذلك، تم اكتشاف تعبير VMP1 الناجم عن المجاعة في الهياكل المنقطة عن طريق التألق المناعي، في حين أنه لم يكن من الممكن اكتشافه تقريبًا في ظل ظروف اكتمال المغذيات (الشكل 2C). يلعب mTOR kinase دورًا مركزيًا في آلية استشعار تجمع الأحماض الأمينية. استجابةً للجوع، يتم تثبيط mTOR، مما يؤدي إلى تحريض الالتهام الذاتي (35Jacinto E. Hall M.N. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2003 ؛ 4: 117-126 Crossref PubMed Scopus (513) الباحث العلمي من Google). نظرًا لأنه يمكن تثبيط mTOR بواسطة الراباميسين، فقد عالجنا خلايا هيلا باستخدام الراباميسين كعامل دوائي للحث على البلعمة الذاتية. وجدنا أن تثبيط mTOR يحث تعبير البروتين VMP1 - mRNA و VMP1 (الشكل 2، A - C). لتحديد ما إذا كان VMP1 مطلوبًا للالتهام الذاتي، قللنا من التعبير عن VMP1 باستخدام استراتيجية الحمض النووي الريبي (siRNA) المتداخلة الصغيرة. تم نقل خلايا هيلا باستخدام VMP1 - siRNA ثم خضعت لبروتوكول التجويع القياسي أو علاج الراباميسين. تم هدم تعبير VMP1 بكفاءة (الشكل 2، D و E). وجدنا أن تكوين البلعمة الذاتية تم تثبيطه بالكامل تقريبًا في خلايا VMP1 - siRNA تحت كلا العلاجين، كما يتضح من توزيع بروتين الانصهار الفلوري RFP - LC3 (الشكل 2F). قمنا بتحليل ثلاث تجارب مستقلة لكل علاج، ووجدنا أن النسبة المئوية لخلايا RFP - LC3 مع تلطيخ نقطي في الخلايا المصابة بـ VMP1 - siRNA كانت منخفضة للغاية مقارنة بالخلايا المصابة بـ siRNA المتدافع (الشكل 2F). تظهر هذه النتائج أن تعبير VMP1 مطلوب للبلعمة الذاتية المستحثة بالمنبهات خارج الخلية. VMP1 يبقى كبروتين غشائي أثناء البلعمة الذاتية - يتنبأ الهيكل الأولي VMP1 ببروتين عبر الغشاء (22Dusetti NJ Jiang Y. Vaccaro MI Tomasini R. Samir Azizi A. Calvo EL Ropolo A. Fiedler F. Mallo GV Dagorn JC Iovanna JL Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002; 290: 641-649 Crossref PubMed Scopus (76) Google Scholar). يتم طي مجموعة GFP بشكل صحيح وتصبح فلورية فقط إذا تم إدخال بروتين غشائي بشكل ثابت في الغشاء (36 Wagner S. Bader M.L. Drew D. de Gier J.W. Trends Biotechnol. 2006 ؛ 24: 364-371 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (211) الباحث العلمي من Google). للتحقق مما إذا كان VMP1 لا يزال في بنية الغشاء، قمنا بنقل الخلايا مع بلازميد تعبير PEGFP - VMP1، وتم استزراع الخلايا في ظروف المغذيات والعوامل الكاملة المزروعة. بعد 24 ساعة، لوحظ تألق GFP لبروتين الانصهار VMP1 - EGFP في أغشية الفجوات المستحثة بالتعبير الخاص بها (الشكل 3A). ثم قمنا بتحليل ما إذا كان VMP1 يتحد مع LC3 الداخلي في الفجوات المستحثة بـ VMP1. أجرينا التألق المناعي باستخدام الأجسام المضادة لـ LC3 ومضاد V5 في خلايا هيلا التي تم نقلها باستخدام بلازميد تعبير VMP1 - V5. وجدنا توطينًا مشتركًا ملحوظًا بين بروتين اندماج VMP1 - V5 و LC3 داخلي المنشأ في الفجوات المستحثة بـ VMP1 (الشكل 3 ب). لمعرفة ما إذا كان VMP1 الداخلي المنشأ يبقى أيضًا كبروتين غشائي أثناء البلعمة الذاتية، أجرينا تجزئة تحت خلوية لخلايا هيلا التي تخضع للبلعمة الذاتية المستحثة بالراباميسين وفحصنا VMP1 في مستحضرات الغشاء بواسطة البقعة الغربية. يوضح الشكل 3 ج أنه على الرغم من أن البروتين لا يمكن اكتشافه في الخلايا غير المعالجة، إلا أن VMP1 موجود في مستحضرات الغشاء من الخلايا التي تخضع للالتهام الذاتي، وتستمر الإشارة عند معالجة أجزاء الغشاء بكلوريد الصوديوم 1.5 متر أو التعرض لدرجة الحموضة 11.0. تشير هذه النتائج إلى أن VMP1 يعمل كبروتين غشائي أثناء البلعمة الذاتية. VMP1 هو بروتين بيكلين 1 ملزم - للحصول على رؤية ميكانيكية حول كيفية تحفيز VMP1 للبلعمة الذاتية، قمنا بتحليل وظيفته في المسار الجزيئي لتكوين البلعمة الذاتية. أثناء البلعمة الذاتية، يُعتقد أن مجمع Beclin 1 - Class III PI3K (37Kihara A. Kabeya Y. Ohsumi Y. Yoshimori T. EMBO Rep. 2001 ؛ 2: 330-335 Crossref PubMed Scopus (724) Google Scholar) يخضع للتوزيع تحت الخلوي إلى بنية غشائية، مما يؤدي في النهاية إلى تجنيد بروتينات البلعمة الذاتية والاقتران المناسب لـ LC3 بالشحوم الفوسفورية الغشائية (19Kihara A. Noda T. Ishihara N. Ohsumi Y. J. Cell Biol. 2001 ؛ 152: 519-530 Crossref PubMed Scopus (804) Google Scholar، 38Mizushima N. Yamamoto A. Hatano M. Koboyashi Y. Kabeya Y. Suzuki K. Tokuhisa T. Ohsumi Y. Yoshimori T. J. Cell Biol. 2001 ؛ 152: 657-668 Crossref PubMed Scopus (1158) الباحث العلمي من Google). ومع ذلك، فإن البروتين عبر الغشاء الذي يتفاعل معه مركب بيكلين 1 لا يزال بعيد المنال. للتحقق مما إذا كان VMP1 هو بروتين غشائي مستهدف يتفاعل معه Beclin 1، قمنا أولاً بتحليل ما إذا كان Beclin 1 يتوضع في غشاء الفجوات المستحثة بـ VMP1. قمنا في الوقت نفسه بنقل خلايا 293T مع بلازميدات تعبير pEGFP - VMP1 و pRFP - LC3 و pECFP - Beclin 1 (تظهر النتائج في الشكل. 4A). وجدنا توطينًا مشتركًا ملحوظًا بين بروتينات الانصهار الفلوري VMP1 و LC3 و Beclin 1، مما يشير إلى أن Beclin 1 يمكن أن يرتبط بأغشية الفجوة المستحثة بـ VMP1. بعد ذلك، درسنا ما إذا كان VMP1 يتفاعل مع Beclin 1. أجرينا اختبار سحب لأسفل باستخدام بروتين الانصهار VMP1 - V5 - His6. تمت معالجة المحللات التي تم تحضيرها من خلايا هيلا المصابة بـ pcDNA4 - VMP1 باستخدام Triton X -100 وتم تحضينها بخرز النيكل أجاروز. بعد غسلها على نطاق واسع، تمت إزالة البروتينات المحتفظ بها باستخدام الإيميدازول وفصلها عن طريق SDS - PAGE متبوعة بالتخثر المناعي المضاد للبيكلين 1 أو الأجسام المضادة V5. تم العثور على VMP1 - V5 و Beclin 1 في الألواح الطينية (الشكل 4B). أظهرت تجارب التحكم أنه لم يتم اكتشاف أي من Beclin 1 أو VMP1 - V5 في جزء الشطف من خلايا pcDNA4 - الفارغة المنقولة. في سلسلة أخرى من التجارب، تم تحضين المحللات من الخلايا المصابة بـ pcDNA4 - VMP1 مع الجسم المضاد لـ Beclin 1. تم احتضان الضوابط مع مصل التحكم. تم فصل الرواسب المناعية ولصقها مناعيًا لـ VMP1 - V5 مع الأجسام المضادة لـ V5. تم اكتشاف VMP1 - V5 في المحللات المعالجة بالأجسام المضادة Beclin 1 ولكن ليس في عناصر التحكم (الشكل 4C). لتحليل الأهمية الفسيولوجية لتفاعل VMP1 - Beclin 1، قمنا بالتحقيق فيما إذا كان VMP1 الداخلي يتفاعل مع Beclin 1 الداخلي في الخلايا التي تطور الالتهام الذاتي الناجم عن الراباميسين من خلال تجارب الترسيب المناعي المشترك. بيكلين الذاتية 1 و