Les facteurs de transcription de la protéine d'activation-1 (AP-1) sont des gènes de réponse précoce impliqués dans un ensemble diversifié de processus de régulation transcriptionnelle. L'ester de phorbol 12-O-tétradécanoylphorbol-13-acétate (TPA) est souvent utilisé pour induire une activité AP-1. Le but de ce travail était d'explorer les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation par le TPA de l'expression génique ubiquitaire de la 5-aminolévulinate synthase (ALAS), la première étape de la biosynthèse de l'hème. Une analyse antérieure de la séquence flanquante 5′ de l'ALAS A révélé l'existence de deux éléments de réponse à l'AMPc (CRE) requis pour l'expression basale et stimulée par l'AMPc. Le fragment −833 à +42 dans la région flanquante 5′ du gène ALAS de rat a été sous-cloné dans un vecteur rapporteur de chloramphénicol acétyltransférase (CAT). Le vecteur d'expression pALAS/CAT a produit une activité CAT significative dans les cellules d'hépatome humain HepG2 transfectées de manière transitoire, qui a été réprimée par le TPA. L'analyse de séquence et de délétion a détecté un élément de réponse TPA (TRE), situé entre −261 et −255 (TRE-ALAS), qui était critique pour la régulation du TPA. Nous avons démontré que c-Fos, c-Jun et JunD sont impliqués dans l'effet inhibiteur du TPA en raison de leur capacité à se lier à TRE-ALAS, mise en évidence par l'analyse de supershift et leur capacité à réprimer l'activité du promoteur dans les tests de transfection. La répression de l'activité du promoteur ALAS par le traitement par TPA ou la surexpression de Fos/Jun a été largement soulagée lorsque la protéine de liaison à la protéine CRE ou p300 a été exprimée de manière ectopique. Lorsque le site TRE a été placé dans un contexte différent par rapport aux sites CRE, il a semblé agir comme un activateur transcriptionnel. Nous proposons que la diminution de l'activité basale HÉLAS observée en présence de TPA puisse refléter une capacité plus faible de ce promoteur à assembler le complexe de pré-initiation productif en raison de la séquestration de la protéine de liaison à la protéine CRE. Nous suggérons également que les propriétés transcriptionnelles de ce site AP-1 dépendraient d'une manière dépendante de la disposition spatiale par rapport aux sites CRE et au site d'initiation de la transcription. Les facteurs de transcription de la protéine d'activation-1 (AP-1) sont des gènes de réponse précoce impliqués dans un ensemble diversifié de processus de régulation transcriptionnelle. L'ester de phorbol 12-O-tétradécanoylphorbol-13-acétate (TPA) est souvent utilisé pour induire une activité AP-1. Le but de ce travail était d'explorer les mécanismes moléculaires impliqués dans la régulation par le TPA de l'expression génique ubiquitaire de la 5-aminolévulinate synthase (ALAS), la première étape de la biosynthèse de l'hème. Une analyse antérieure de la séquence flanquante 5′ de l'ALAS A révélé l'existence de deux éléments de réponse à l'AMPc (CRE) requis pour l'expression basale et stimulée par l'AMPc. Le fragment −833 à +42 dans la région flanquante 5′ du gène ALAS de rat a été sous-cloné dans un vecteur rapporteur de chloramphénicol acétyltransférase (CAT). Le vecteur d'expression pALAS/CAT a produit une activité CAT significative dans les cellules d'hépatome humain HepG2 transfectées de manière transitoire, qui a été réprimée par le TPA. L'analyse de séquence et de délétion a détecté un élément de réponse TPA (TRE), situé entre −261 et −255 (TRE-ALAS), qui était critique pour la régulation du TPA. Nous avons démontré que c-Fos, c-Jun et JunD sont impliqués dans l'effet inhibiteur du TPA en raison de leur capacité à se lier à TRE-ALAS, mise en évidence par l'analyse de supershift et leur capacité à réprimer l'activité du promoteur dans les tests de transfection. La répression de l'activité du promoteur ALAS par le traitement par TPA ou la surexpression de Fos/Jun a été largement soulagée lorsque la protéine de liaison à la protéine CRE ou p300 a été exprimée de manière ectopique. Lorsque le site TRE a été placé dans un contexte différent par rapport aux sites CRE, il a semblé agir comme un activateur transcriptionnel. Nous proposons que la diminution de l'activité basale HÉLAS observée en présence de TPA puisse refléter une capacité plus faible de ce promoteur à assembler le complexe de pré-initiation productif en raison de la séquestration de la protéine de liaison à la protéine CRE. Nous suggérons également que les propriétés transcriptionnelles de ce site AP-1 dépendraient d'une manière dépendante de la disposition spatiale par rapport aux sites CRE et au site d'initiation de la transcription. protéine d'activation-1 4α-phorbol 12,13-diacétate 5-aminolévulinate synthase chloramphénicol acétyltransférase élément sensible à l'AMPc protéine CREB-protéine de liaison élément cyclique sensible à l'AMP 8-(4-chlorophénylthio)-cAMP hémagglutinine récepteurs d'hormones nucléaires protéine kinase A et C, respectivement 12-O-tétradécanoylphorbol-13-acétate élément sensible au TPA Les facteurs de transcription de la protéine d'activation-1 (AP-1)1 sont des gènes de réponse précoce impliqués dans un ensemble diversifié de processus de régulation transcriptionnelle. AP-1 est un complexe dimérique composé de membres des protéines de la famille Fos et Jun (1Wisdom R. Exp. Cell Res. 1999 ; 253: 180-185Crossref PubMed Scopus (338) Google Scholar). Ce complexe se lie à la séquence d'ADN consensus TGA(G/C)TCA, appelée 12-O-tétradécanoylphorbol-13-acétate (TPA)-réponse element (TRE) ou AP-1, sites trouvés dans une variété de promoteurs de gènes, tels que les facteurs de croissance, les chimiokines et les cytokines (2Angel P. Imagawa M. Chiu R. Stein B. Imbra R.J. Rahmsdorf H.J. Jonat C. Herrlich P. Karin M. Cell. 1987 ; 49: 729-739Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (2155) Google Scholar). La famille Fos contient quatre protéines (c-Fos, Fos-B, Fra-1 et Fra-2), tandis que la famille Jun est composée de trois (c-Jun, JunB et JunD). Fos et Jun sont membres du groupe de base des protéines à fermeture éclair à leucine, et ce motif de base sert de médiateur à la formation d'homo- et d'hétérodimères. c-Jun est le composant majeur du complexe AP-1, et c-Fos est son partenaire le plus connu (3Nishina H. Sato H. Suzuki T. Sato M. Iba H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1990 ; 87: 3619-3623Crossref PubMed Scopus (215) Google Scholar,4Angel P. Karin M. Biochim. Biophys. Acta. 1991 ; 1072: 129-157Crossref PubMed Scopus (3270) Google Scholar). AP-1 est activé par des mitogènes, des oncoprotéines, des cytokines et des agents de stress tels que la lumière ultraviolette. L'ester de phorbol TPA est souvent utilisé pour induire une activité AP-1. L'activation de cette protéine peut être médiée à la fois par des mécanismes indépendants et dépendants de la transcription, qui impliquent des modifications post-traductionnelles de ses composants ou des augmentations de l'expression de leurs gènes correspondants, respectivement (5Karin M. J. Biol. Chem. 1995 ; 270: 16483-16486Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2256) Google Scholar,6Karin M. Hunter T. Curr. Biol. 1995 ; 5: 747-757Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (666) Google Scholar). Les coactivateurs de transcription relient les facteurs de transcription et les composants de l'appareil transcriptionnel basal (7Horwitz K.B. Jackson T.A. Bain D.L. Richer J.K. Takimoto G.S. Tung I. Mol. Endocrinol. 1996 ; 10: 1167-1177Crossref PubMed Scopus (837) Google Scholar). Une classe importante de coactivateurs comprend la protéine de liaison à l'élément de réponse à l'AMPc (CREB) (CBP) et la protéine p300 hautement apparentée, qui ont été initialement identifiées pour leur capacité à interagir fortement avec CREB (8Arias J. Alberts A.S. Brindle P. Claret F.X. Smeal T. Karin M. Feramisco J. Montminy M. Nature. 1994 ; 370: 226-229Crossref PubMed Scopus (681) Google Scholar). Par la suite, le CBP et le p300 ont été identifiés comme des cofacteurs essentiels pour un certain nombre de facteurs de transcription nucléaire, y compris le complexe AP-1 (9Albanese C. D'Amico M. Reutens A.T., Fu, M. Watanabe G. Lee R.J. Kitsis R.N. Henglein B. Avantaggiati M. Somasundaram K. Thimmapaya B. Pestell R.G. J. Biol. Chem. 1999 ; 274: 34186-34195Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (170) Google Scholar), plusieurs composants de la machinerie transcriptionnelle basale (TBP et TFIIB) (10Giordano A. Avantaggiati M.L. J. Cell. Physiol. 1999 ; 181: 218-230Crossref PubMed Scopus (256) Google Scholar), autres histone acétyltransférases (SRC-1, ACTR et P/CAF) (11Lee S. Kim H., Na, S. Kim T. Choi H., Im, S. Lee J.W. J. Biol. Chem. 1998 ; 273: 16651-16654Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (178) Google Scholar), developmental proteins (GATA-1, MEF-2, Pit-1) (12Liu S.L. Rand A. Kelm R.J., Jr. Getz M.J. Oncogene. 2000 ; 19: 3352-3362Crossref PubMed Scopus (18) Google Scholar), oncoprotéines virales (E1A, grand antigène T et Tax) (13Goodman R.H. Smolik S. Genes Dev. 2000 ; 14: 1553-1577PubMed Google Scholar), et des récepteurs nucléaires (14Lee S.K. Jung S.Y. Kim Y.S., Na, S.Y. Lee Y.C. Lee J.W. Mol. Endocrinol. 2001 ; 15: 241-254Crossref PubMed Scopus (44) Google Scholar). Ces protéines coactivatrices sont importantes non seulement en raison de leur rôle dans la régulation transcriptionnelle positive à partir des sites de liaison à l'ADN, mais aussi en raison de leur rôle de médiateurs de la diaphonie entre différentes voies de transduction du signal (15Cheng X. Reginato M.J. Andrews N.C. Lazar M.A. Mol. Cell. Biol. 1997 ; 17: 1407-1416Crossref PubMed Scopus (97) Google Scholar). Bien que des éléments de liaison négatifs aient été décrits, la répression est principalement menée par interférence avec d'autres facteurs de transcription, dont AP-1 est l'un des plus représentatifs (16Saatcioglu F. Claret F.X. Karin M. Semin. Cancer Biol. 1994 ; 5: 347-359PubMed Google Scholar). Il a été rapporté que le CBP joue un rôle significatif dans la diaphonie négative entre les membres de la famille des récepteurs nucléaires, y compris le récepteur des glucocorticoïdes, le récepteur de l'acide rétinoïque, le récepteur de l'hormone thyroïdienne et l'activité AP-1, sans inhibition de la liaison à l'ADN (17Kamei Y., Xu, L. Heinzel T. Torchia J. Kurokawa R. Gloss B. Lin S.C. Heyman R.A. Rose D. Glass C.K. Rosenfeld M.G. Cell. 1996 ; 85: 403-414Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1926) Google Scholar, 18 Ko L. Cardona G.R. Chin W.W. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000 ; 97: 6212-6217Crossref PubMed Scopus (128) Google Scholar, 19DiSepio D. Sutter M. Johnson A.T. Chandraratna R.A. Nagpal S. Mol. Cell Biol. Res. Commun. 1999 ; 1: 7-13Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). Plusieurs approches indépendantes ont révélé que la CBP est nécessaire pour l'activation à la fois de l'AP-1 et des récepteurs nucléaires hormonaux (NHR). Comme cela a été suggéré, la concurrence pour limiter les quantités de CBP peut expliquer de nombreux effets inhibiteurs de la NHR sur l'activation de l'AP-1 (17Kamei Y., Xu, L. Heinzel T. Torchia J. Kurokawa R. Gloss B. Lin S.C. Heyman R.A. Rose D. Glass C.K. Rosenfeld M.G. Cell. 1996 ; 85: 403-414Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1926) Google Scholar, 20Mc Kenna N.J. Lanz R.B. O'Malley B.W. Endocr. Rev. 1999 ; 20: 321-344PubMed Google Scholar). Ainsi, sur les gènes contenant des sites de liaison NHR mais dépourvus de sites de liaison AP-1, la régulation positive par NHR ligandé est inhibée par l'activation de AP-1. Inversement, la NHR ligandée peut inhiber la transcription médiée par AP-1. Dans cet article, nous présentons un mécanisme distinct de diaphonie négative entre CREB et AP-1 qui implique une compétition par CBP sur l'activité transcriptionnelle du promoteur du gène de la 5-aminolévulinate synthase (ALAS). ALAS is a mitochondrial matrix enzyme that catalysates the first and rate-limiting step of heme biosynthesis (21Kappas A. Sassa S. Galbraith R.A. Nordmann Y. Scriver c.r. Beaudet A.L. Sly W.S. Valle D. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Diseases. 7th Ed. McGraw-Hill Inc., New York1995: 2103-2159Google Scholar). Il existe deux isoenzymes ALAS apparentés qui sont codés par deux gènes distincts situés sur des chromosomes différents. L'enzyme spécifique des cellules érythroïdes ou ALAS-2 est régulée sur le plan du développement, et elle augmente considérablement pendant l'érythropoïèse pour répondre à la demande d'hème pendant la production d'hémoglobine. La deuxième enzyme, omniprésente ou de type hépatique ALAS (ALAS-1), est probablement exprimée dans tous les tissus pour fournir de l'hème aux cytochromes et autres hémoprotéines (21Kappas A. Sassa S. Galbraith R.A. Nordmann Y. Scriver c.r. Beaudet A.L. Sly W.S. Valle D. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Diseases. 7th Ed. McGraw-Hill Inc., New York1995: 2103-2159Google Scholar, 22 mai B.K. Dogra S.C. Sadlon T.J. Bhasker c.r. Cox T.C. Bottomley S.S. Prog. Acide nucléique Rés. Mol. Biol. 1995 ; 51: 1-51Crossref PubMed Scopus (123) Google Scholar). Expression of ALAS in the liver was found to be subject to feedback regulation by heme (21Kappas A. Sassa S. Galbraith R.A. Nordmann Y. Scriver c.r. Beaudet A.L. Sly W.S. Valle D. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Diseases. 7th Ed. McGraw-Hill Inc., New York1995: 2103-2159Google Scholar). En plus de ce mécanisme majeur de régulation, nous avons démontré que l'AMPc induit et que les esters de phorbol répriment l'expression de l'ALAS hépatique par l'activation de la protéine kinase A (PKA) et de la protéine kinase C (PKC), respectivement (23Varone C.L. Cañepa E.T. Arch. Biochem. Biophys. 1997 ; 341: 259-266Crossref PubMed Scopus (11) Google Scholar, 24Varone C.L. Giono L.E. Ochoa A. Zakin M.M. Cánepa E.T. Arch. Biochem. Biophys. 1999 ; 372: 261-270Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar). Les études réalisées sur la région 5′ -régulatrice du gène ALAS ont montré la présence de deux sites fonctionnels de type CRE qui sont nécessaires non seulement pour l'induction médiée par l'AMPc mais aussi pour l'expression basale. Ces sites sont délimités par le CREB et recrutent le coactivateur CBP (25Giono L.E. Varone C.L. Cánepa E.T. Biochem. J. 2001 ; 353: 307-316Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar). Le but de cette étude était d'examiner le mécanisme moléculaire sous-jacent à l'expression du gène ALAS inhibé par le TPA. L'analyse de la délétion du promoteur a été réalisée sur le gène ALAS, qui, comme nous l'avons déjà démontré, est réprimé par le TPA (23Varone C.L. Cá nepa E.T. Arch. Biochem. Biophys. 1997 ; 341: 259-266Crossref PubMed Scopus (11) Google Scholar). Nous avons constaté qu'un site de liaison à l'AP-1 (TRE-ALAS) était crucial pour l'inhibition du promoteur ALAS malgré sa réponse positive largement rapportée au TPA chez plusieurs promoteurs (26Sakamoto S. Taniguchi T. J. Biol. Chem. 2001 ; 276: 37237-37241Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (20) Google Scholar, 27 Simon C. Simon M. Vucelic G. Hicks M.J. Plinkert P.K. Koitschev A. Zenner H.P. Exp. Cell Res. 2001 ; 271: 344-355Crossref PubMed Scopus (105) Google Scholar). Les complexes hétérodimères nucléaires qui se lient à TRE-ALAS seraient composés de c-Fos et de c-Jun ou de c-Fos et de JunD. De plus, nos données indiquent que la surexpression de CBP a soulagé la répression du TPA, suggérant que la séquestration de CBP empêche la formation en aval du complexe CREB·CBP nécessaire à la transcription basale du gène ALAS. Cette compétition pour limiter la quantité intracellulaire d'un coactivateur commun pourrait expliquer l'effet inhibiteur bizarre du TPA sur l'expression du gène ALAS. Enfin, nous avons observé différentes réponses au TPA en fonction de la position relative des sites TRE et CRE sur le promoteur HÉLAS. Par conséquent, le complexe AP-1 sur TRE-ALAS interférerait de manière dépendante de la disposition avec la machinerie de transcription par séquestration de CBP pendant l'inhibition de l'expression du gène ALAS. Le milieu essentiel minimum d'Eagle, l'isothiocyanate de guanidine, le TPA, le 4α-phorbol-12,13-diacétate (4αPDA), l'agarose, la calphostine C, le chloramphénicol, le butyryl coenzyme A, le 8-CPT-cAMP, l'ando-nitrophényl-β-d-galactopyranoside ont été achetés chez Sigma. Le [ring-3,5-3H]Chloramphénicol (activité spécifique 1,1-2,2 GBq/mmol), le [γ-32P]ATP (activité spécifique 222 TBq/mmol) et le [α-32P]dCTP (activité spécifique 111 TBq/mmol) ont été achetés chez PerkinElmer Life Sciences. Le kit d'amorces aléatoires, les endonucléases de restriction et les enzymes modifiant l'ADN provenaient de New England Biolabs, Inc. Tous les autres produits chimiques étaient de qualité analytique. Les oligodésoxynucléotides ont été synthétisés chimiquement par Bio-Synthesis Inc. (Lewisville, TX). Les vecteurs d'expression suivants ont été utilisés comme indiqué dans chaque expérience. Le plasmide pALAS/CAT contient la région flanquante 5′ (−833 à +42 pb) du gène ALAS ubiquitaire de rat cloné en amont du gène rapporteur CAT dans le vecteur pBLCAT6. Les plasmides mutants de délétion P-459ALAS/CAT, p-354ALAS/CAT, p-156ALAS/CAT et p-75ALAS/CAT ont été décrits précédemment (25Giono L.E. Varone C.L. Cánepa E.T. Biochem. J. 2001 ; 353: 307-316Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar). Les vecteurs pSG5 codant pour des formes sauvages de c-Fos, c-Jun, JunB ou JunD, et un vecteur pRc/RSV codant pour l'ADNc de la version sauvage de CBP ont été gentiment fournis par le Dr P. Sassone-Corsi (Institut de Géographie et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Strasbourg, France). Le vecteur pCEFLp300 codant l'ADNc pour la version de type sauvage de p300 était un cadeau du Dr J. Silvio Gutkind (NIDCR, National Institutes of Health, Bethesda, MD). Le pCMV/A-Fos (désigné pA-Fos) est un vecteur d'expression dirigé par le cytomégalovirus dans lequel la région basique normale critique pour la liaison de l'ADN à la terminaison N de la fermeture à glissière à leucine de Fos a été remplacée par une séquence acide (un don généreux du Dr Charles Vinson, NCI, National Institutes of Health, Bethesda, MD) (28Olive M. Krylov D. Echlin D.R. Gardner K. Taparowsky E. Vinson C. J. Biol. Chem. 1997 ; 272: 18586-18594Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (243) Google Scholar). Le plasmide pTRE-tk-CAT contient deux séquences consensus TRE en amont du promoteur de la thymidine kinase HSV (29Icard-Liepkalns C. Biguet N.F. Vyas S. Robert J.J. Sassone-Corsi P. Mallet J.J. Neurosci. Res. 1992 ; 32: 290-298Crossref PubMed Scopus (105) Google Scholar). Le vecteur pASCAT hétérologue, dans lequel une copie de la séquence −354 à − 156 pb du gène ALAS a été placée en amont du promoteur de la thymidine kinase, a été généré par clonage du fragment FlII/StuI de pACAT dans le site SalI de pBLCAT2. De même, les vecteurs pAECATd ou pAECATi contenant une copie de la séquence −354 à − 38 pb du gène ALAS en position droite ou inversée, respectivement, en amont du promoteur de la thymidine kinase ont été générés par clonage du fragment AflII/BstEII de pACAT dans le site SalI de pBLCAT2. Les mutations ont été générées par mutagenèse dirigée par réaction en chaîne de la polymérase (Stratagene, La Jolla, CA). Dans les vecteurs p-354ALAS/CATm, pAECATdm et pAECATim, le site TRE-ALAS a été muté de TGACGCA de type sauvage (brin codant) à TGACGTG (brin codant). La fidélité de tous les vecteurs mutés a été vérifiée par la séquence d'ADN. Le plasmide pCEFL contenant le gène de la β-galactosidase a également été utilisé. Pour effectuer des tests de transfection, les plasmides ont été purifiés à l'aide du WizardPlus Maxipreps (Promega Co). La concentration d'ADN a été estimée par spectrophotométrie. La lignée cellulaire d'hépatome humain HepG2 a été cultivée en tant que cultures monocouches dans un milieu essentiel minimum supplémenté avec 10% (v/v) de sérum de veau foetal inactivé par la chaleur et 1% de pénicilline-streptomycine, 100 μm d'acides aminés non essentiels et 2 mm de glutamine. Les cellules ont été cultivées dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO2 à 37 °C. Pour l'analyse de l'ARN, le phénobarbital et le TPA ont été ajoutés aux cellules HepG2 à 75 % de confluence dans des plaques de culture tissulaire de 100 mm pour les temps et les concentrations détaillés dans les légendes de la figure. Le phénobarbital est dissous dans 0,1 ml du milieu correspondant. Les esters de phorbol et la calphostine C ont été dissous dans un petit volume (moins de 0,5% du volume total des milieux de culture) de Me2SO. L'ARN cellulaire total a été isolé à partir de cellules HepG2 cultivées selon Chomczinsky et Sacchi (30Chomczinsky P. Sacchi N. Anal. Biochem. 1987 ; 71: 341-350Google Scholar). Le rendement et la pureté des échantillons d'ARN ont été évalués par le rapport d'absorbance à 260 et 280 nm. Pour l'analyse Northern blot, 20 μg d'ARN total ont été dénaturés, électrophorés dans des gels de glyoxal-agarose à 1% et transférés sur des membranes de nylon (Hybond N,Amersham Biosciences). Les membranes ont été hybridées séquentiellement avec des sondes marquées au 32P au foie humain HÉLAS et à la β-tubuline. Pour détecter l'ARNm ALAS, un oligodésoxynucléotide 26-mère a été synthétisé complémentaire aux bases +328 à +353 de l'ARNm ALAS ubiquitaire humain (31Bishop D.F. Nucleic Acids Res. 1990 ; 18: 7187-7188Crossref PubMed Scopus (50) Google Scholar). L'oligodésoxynucléotide a été purifié et marqué en 5′à l'aide de [γ-32P]ATP et de la T4polynucléotide kinase. La sonde résultante avait une activité spécifique d'environ 5–6 × 103 cpm/fmol. L'hybridation a été réalisée pendant la nuit à 70 °C dans la même solution de pré-hybridation en ajoutant l'oligodésoxynucléotide marqué au 32P (3,0 × 105 cpm/cm2) tel que décrit précédemment (24Varone C.L. Giono L.E. Ochoa A. Zakin M.M. Cánepa E.T. Arch. Biochem. Biophys. 1999 ; 372: 261-270Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar). Pour détecter l'ARNm de la β-tubuline, l'ADNc de la β-tubuline de poulet (un don généreux du Dr J. Messina, Floride) a été marqué par amorçage aléatoire à l'aide de [α-32P]dCTP et de Klenow à une activité spécifique d'environ 6 × 108 cpm/μg. Les membranes ont été décapées, préhybridées, hybridées et lavées dans des conditions standard décrites par Sambrook et al. (32Sambrook, J., and Russell, D. W. (2001) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 3rd Ed., pp. 7.42–7.45 and 17.48–17.51, Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor, NYGoogle Scholar). Les autoradiographies ont été obtenues en exposant ces taches à un film Kodak XAR-5 avec un écran intensificateur pendant 3–5 jours à −70 °C. Les transfections transitoires HepG2 ont été réalisées selon la méthode standard de précipitation au phosphate de calcium telle que décrite précédemment (25Giono L.E. Varone C.L. Cánepa E.T. Biochem. J. 2001 ; 353: 307-316Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar). En bref, 4 μg de pALAS/CAT ou de ses dérivés et 6 μg de pCEFLβgal ont été co-transfectés en 5 × 105 cellules plaquées sur des boîtes de Petri de 35 mm. Le plasmide β-galactosidase a été utilisé comme étalon interne pour normaliser l'efficacité de la transfection. L'utilisation d'autres plasmides cotransfectés est indiquée dans chaque expérience. La quantité de vecteurs d'expression Fos/Jun, CBP et p300 qui ont été utilisés dans les différentes expériences a été déterminée précédemment à l'aide de courbes dose-réponse. Différentes quantités des plasmides mentionnés ont été co-transfectées dans les cellules HepG2 avec p-354ALAS/CAT, et l'expression de CAT a été mesurée. La quantité minimale de chaque plasmide qui a produit l'effet maximal a été utilisée dans des expériences ultérieures. La concentration finale d'ADN a été ajustée à une boîte de 30 μg/35 mm avec un porteur d'ADN non spécifique. Les transfections de contrôle avec le porteur seul et le porteur plus le vecteur pBLCAT6 ou pBLCAT2 ont été effectuées en parallèle. Seize heures plus tard, le milieu a été remplacé par 3 ml de milieu sans sérum contenant les réactifs indiqués dans chaque expérience et incubé pendant 24 h. Ensuite, des cellules ont été collectées et l'activité du CHAT a été mesurée dans des extraits cellulaires comme décrit précédemment (25Giono L.E. Varone C.L. Cá nepa E.T. Biochem. J. 2001 ; 353: 307-316Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar) selon la méthode d'extraction de phase Seed and Sheen (33Seed B. Sheen J.Y. Gene. 1988 ; 67: 271-277Crossref PubMed Scopus (830) Google Scholar). L'activité de la β-galactosidase a été déterminée par spectrophotométrie dans les extraits de cellules transfectées (32Sambrook, J., and Russell, D. W. (2001) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 3rd Ed., pp. 7.42-7.45 and 17.48-17.51, Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor, NYGoogle Scholar). L'activité CAT a été exprimée comme la quantité de chloramphénicol radiomarqué acétylée par 1 mg de protéine en 1 min et normalisée avec une activité β-galactosidase. L'activité β-Galactosidase n'a été modifiée par aucun des traitements utilisés. La concentration protéique des extraits cellulaires a été déterminée par le test de Bradford (34Bradford M. Anal. Biochem. 1976 ; 72: 248-254Crossref PubMed Scopus (216391) Google Scholar). Des extraits nucléaires ont été préparés à partir de cellules HepG2 stimulées et non stimulées par le TPA, comme décrit par Andrews et Faller (35Andrews N.C. Faller D.V. Nucleic Acids Res. 1991 ; 19: 2499-2503Crossref PubMed Scopus (2211) Google Scholar). Les sondes d'ADN double brin et les compétiteurs froids utilisés étaient TRE-ALAS (site AP-1 situé à −261 pb), 5′ -AGGAGTCTGACGCACAGGGCT-3 ′ et le mutant 5′ -AGGAGTCTGACGTGCAGGGCT-3 ′, appelé TRE-ALASmut, dans lequel les bases soulignées ont été mutées pour perturber la liaison spécifique des protéines de liaison à l'AP-1. Un oligodésoxynucléotide de contrôle positif contenant un site de liaison consensus AP-1, 5′-CGCTTGATGAGTCAGCCGGAA-3′, et un oligodésoxynucléotide contenant un site consensus CRE correspondant aux −58 à −31 pb du promoteur du gène de la somatostatine de rat 5′-AGAGATTGCCTGACGTCAGAGAGCTAG-3′, ont également été utilisés. Les oligodésoxynucléotides ont été marqués à l'extrémité 5′ avec la T4polynucléotide kinase et 222 TBq/mmol [γ-32P]dATP à 37 °C pendant 60 min. Des réactions de liaison ont été réalisées en mélangeant 10 μg de l'extrait nucléaire avec 2 μg de poly(dI-dC) et 150 000 dpm de la sonde marquée dans du tampon TM (Tris-HCl 50 mm, pH 7,9, MgCl2 12,5 mm, EDTA 1 mm, dithiothréitol 1 mm, glycérol 20% (v/v)) jusqu'à un volume final de 20 μl et incubé à température ambiante pendant 30 min. Lorsqu'il a été noté, l'extrait nucléaire a été incubé pendant 20 min à température ambiante dans un mélange liant avec l'excès molaire indiqué d'ADN concurrent non marqué avant l'ajout de la sonde marquée. Après la réaction de liaison, l'électrophorèse a été réalisée à travers un gel de polyacrylamide non dénaturant à 5% contenant 0,25x TBE (1x TBE : 50 mm de Tris borate, pH 8,3, 1 mm d'EDTA). Le gel a ensuite été séché et une autoradiographie a été réalisée. L'analyse de supershift a été réalisée en incubant l'extrait nucléaire avec 3 μl d'anticorps spécifique à 4 °C pendant 4 h avant les tests de changement de bande déjà décrits. Les anticorps contre c-Fos, c-Jun et JunD ont été achetés auprès de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Californie). Les cellules HepG2 ont été plaquées sur des boîtes de 100 mm (2 × 106) et transfectées avec 2,5 μg de vecteur d'expression CBP, où le CBP a été marqué avec de l'HA, ou le vecteur principal en utilisant le réactif de transfection Escort selon les recommandations du fabricant (Sigma). Deux jours après la transfection, les lysats cellulaires totaux ont été préparés dans un tampon de test de précipitation radio-immunitaire (1 solution saline tamponnée au phosphate, 1 % de Nonidet P-40, 0,5 % de désoxycholate de sodium, 0,1 % de SDS, 10 μg/ml de fluorure de phénylméthylsulfonyle, 60 μg/ml d'aprotinine et 1 mm d'orthovanadate de sodium). Les lysats ont été centrifugés à 10 000 × g pendant 10 min pour éliminer les débris cellulaires. Les lysats éliminés (100 μg) ont été immunoprécipités avec un anticorps monoclonal anti-HA (Santa Cruz). Les complexes immuns ont été récupérés sur des billes de protéine A/G-agarose (Santa Cruz) pendant 1 h à 4 °C, puis lavés 4 fois avec une solution saline tamponnée au phosphate. Les protéines précipitées ont été remises en suspension dans un tampon d'échantillon contenant 2% de SDS et 30 mmβ-mercaptoéthanol, bouillies pendant 3 min, fractionnées par SDS-PAGE sur un gel à 10%, puis tamponnées sur une membrane de nitrocellulose. La membrane a ensuite été immunoblottée avec un anti-phospho-CREB polyclonal anti- lapin (Cell Signaling Technology). L'anticorps a été détecté à l'aide d'IgG anti-rabbit de chèvre liées à la peroxydase de raifort (Sigma) et visualisé par les systèmes de signalisation Pierce Super Signal Ultra Chemiluminescence et un analyseur de bioimagerie Fujifilm LAS-1000. Pour l'immunoblotting direct des protéines cellulaires, les lysats cellulaires totaux des échantillons parallèles ont été fractionnés par électrophorèse en SDS-PAGE sur un gel à 10%, et les protéines ont été transférées sur une membrane de nitrocellulose. La protéine CREB a été détectée à l'aide de l'anticorps polyclonal de lapin anti-CREB (signalisation cellulaire). Les complexes immuns ont été visualisés par chimiluminescence comme décrit ci-dessus. Nous avons d'abord étudié l'effet du TPA sur l'expression du gène ALAS dans les cellules HepG2 dans des conditions basales ou induites. Ces cellules ont été incubées avec du TPA de 1 μm jusqu'à 24 h en présence ou en l'absence de phénobarbital de 0,6 mm, un inducteur bien connu de l'expression du gène ALAS (36 Schuurmans M.M. Hoffmann F. Lindberg R.L. Meyer U.A. Hepatology. 2001 ; 33: 1217-1222Crossref PubMed Scopus (21) Google Scholar). L'analyse par Northern blot a montré que dans les deux cas, il y avait une diminution dépendante du temps des niveaux d'ARNm pour HLA, suggérant que le TPA inhibait l'expression du gène HLA dans les cellules HepG2 (Fig. 1 A). La relation concentration-réponse du TPA pour l'inhibition de l'ARNm de l'ALAS a révélé un effet dose-dépendant. Le TPA était efficace sur une plage de concentration de 10−8 à 10−5m, et l'inhibition maximale était atteinte à 10−6m et plus (Fig. 1 B). Ces résultats concordent avec les observations antérieures faites dans des cultures primaires d'hépatocytes de rat (23Varone C.L. Cánepa E.T. Arch. Biochem. Biophys. 1997 ; 341: 259-266Crossref PubMed Scopus (11) Google Scholar). Pour déterminer si les séquences dans la région flanquante 5′ du gène ALAS pourraient conférer une réactivité au TPA, nous avons fusionné environ 870 pb de cette région au gène rapporteur bactérien pour le CHAT. Les cellules HepG2 ont été transfectées de manière transitoire avec ce vecteur ALAS/CAT, puis incubées avec différentes quantités de TPA avant la récolte et l'analyse de l'activité CAT (Fig. 1 C). Le TPA a provoqué une inhibition dose-dépendante de l'expression de HÉLAS/CHAT avec une diminution maximale de près de 5 fois dans les cellules non traitées et de 8 fois dans les cellules exposées à 0,6 mm de phénobarbital. L'action du 4αPDA, un analogue du TPA inefficace dans la promotion tumorale et l'activation de la PKC, a été testée pour exclure la possibilité d'un effet inhibiteur général dû à l'incubation avec des esters de phorbol. L'ajout de 1 μm4αPDA n'a pas permis de réduire l'expression HÉLAS/CHAT (données non présentées). Dans de nombreux types de cellules, un traitement prolongé avec des esters de phorbol a entraîné une déplétion presque complète de la PKC cellulaire. Parce que l'activation de la PKC a conduit à l'inhibition de l'expression du gène ALAS, les cellules HepG2 transfectées de manière transitoire avec ALAS/CAT ont été prétraitées avec 1 μm de TPA pendant 12 h pour déterminer si la diminution de la PKC par translocation vers la membrane cellulaire empêchait cette inhibition. Nous avons observé qu'une stimulation prolongée de la PKC entraînait le blocage de l'inhibition de l'ALAS par le TPA à la fois dans des conditions basales et stimulées par le phénobarbital (données non présentées). En outre, l'incubation de cellules HepG2 transfectées par ALAS/CAT avec de la calphostine C 1 μm, un inhibiteur de la PKC, a entraîné le blocage de l'effet inhibiteur du TPA 1 μm sur l'activité du promoteur ALAS (Fig. 2). Ces résultats suggèrent que la PKC est impliquée dans l'effet inhibiteur de l'expression du gène ALAS. Pour identifier les éléments de réponse agissant dans la région flanquante 5′ du gène ALAS du rat qui sont sensibles au TPA, une série de mutants de délétion progressivement plus longs de ALAS/CAT ont été construits. Comme dans le cas de HAS/CAT, ces mutants promoteurs de délétion ont été transfectés de manière transitoire dans les cellules HepG2 et testés pour l'activité CAT en l'absence et en présence de 1 μm de TPA. Comme le montre la figure 3, la délétion progressive des séquences de −833 à −354 pb n'a pas altéré de manière significative l'inhibition médiée par le TPA des acti promoteurs

Los factores de transcripción de la proteína de activación 1 (AP-1) son genes de respuesta temprana implicados en un conjunto diverso de procesos reguladores de la transcripción. El éster de forbol 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) se usa a menudo para inducir la actividad de AP-1. El propósito de este trabajo fue explorar los mecanismos moleculares involucrados en la regulación del TPA de la expresión génica ubicua de la 5-aminolevulinato sintasa (ALAS), el primer paso de control de la velocidad de la biosíntesis del hemo. El análisis previo de la secuencia flanqueante 5'de ALAS reveló la existencia de dos elementos de respuesta al AMPc (CRE) necesarios para la expresión basal y estimulada por AMPc. El fragmento -833 a +42 en la región flanqueante 5'del gen ALAS de rata se subclonó en un vector indicador de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). El vector de expresión pALAS/CAT produjo una actividad CAT significativa en células de hepatoma humano HepG2 transfectadas transitoriamente, que fue reprimida por TPA. El análisis de secuencia y eliminación detectó un elemento de respuesta a TPA (TRE), ubicado entre-261 y -255 (TRE-ALAS), que fue crítico para la regulación de TPA. Demostramos que c-Fos, c-Jun y JunD están involucrados en el efecto inhibidor de TPA debido a su capacidad para unirse a TRE-ALAS, evidenciado por el análisis de superdesplazamiento y su capacidad para reprimir la actividad del promotor en ensayos de transfección. La represión de la actividad del promotor ALAS por el tratamiento con TPA o la sobreexpresión de Fos/Jun se alivió en gran medida cuando la proteína de unión a la proteína CRE o p300 se expresó ectópicamente. Cuando el sitio TRE se colocó en un contexto diferente con respecto a los sitios CRE, pareció actuar como un potenciador transcripcional. Proponemos que la disminución en la actividad basal de ALAS observada en presencia de TPA puede reflejar una menor capacidad de este promotor para ensamblar el complejo de preiniciación productivo debido al secuestro de proteínas de unión a proteínas CRE. También sugerimos que las propiedades transcripcionales de este sitio AP-1 dependerían de una manera dependiente de la disposición espacial con respecto a los sitios CRE y al sitio de inicio de la transcripción. Los factores de transcripción de la proteína de activación 1 (AP-1) son genes de respuesta temprana implicados en un conjunto diverso de procesos reguladores de la transcripción. El éster de forbol 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) se usa a menudo para inducir la actividad de AP-1. El propósito de este trabajo fue explorar los mecanismos moleculares involucrados en la regulación del TPA de la expresión génica ubicua de la 5-aminolevulinato sintasa (ALAS), el primer paso de control de la velocidad de la biosíntesis del hemo. El análisis previo de la secuencia flanqueante 5'de ALAS reveló la existencia de dos elementos de respuesta al AMPc (CRE) necesarios para la expresión basal y estimulada por AMPc. El fragmento -833 a +42 en la región flanqueante 5'del gen ALAS de rata se subclonó en un vector indicador de cloranfenicol acetiltransferasa (CAT). El vector de expresión pALAS/CAT produjo una actividad CAT significativa en células de hepatoma humano HepG2 transfectadas transitoriamente, que fue reprimida por TPA. El análisis de secuencia y eliminación detectó un elemento de respuesta a TPA (TRE), ubicado entre-261 y -255 (TRE-ALAS), que fue crítico para la regulación de TPA. Demostramos que c-Fos, c-Jun y JunD están involucrados en el efecto inhibidor de TPA debido a su capacidad para unirse a TRE-ALAS, evidenciado por el análisis de superdesplazamiento y su capacidad para reprimir la actividad del promotor en ensayos de transfección. La represión de la actividad del promotor ALAS por el tratamiento con TPA o la sobreexpresión de Fos/Jun se alivió en gran medida cuando la proteína de unión a la proteína CRE o p300 se expresó ectópicamente. Cuando el sitio TRE se colocó en un contexto diferente con respecto a los sitios CRE, pareció actuar como un potenciador transcripcional. Proponemos que la disminución en la actividad basal de ALAS observada en presencia de TPA puede reflejar una menor capacidad de este promotor para ensamblar el complejo de preiniciación productivo debido al secuestro de proteínas de unión a proteínas CRE. También sugerimos que las propiedades transcripcionales de este sitio AP-1 dependerían de una manera dependiente de la disposición espacial con respecto a los sitios CRE y al sitio de inicio de la transcripción. proteína de activación-1 4α-forbol 12,13-diacetato 5-aminolevulinato sintasa cloranfenicol acetiltransferasa proteína del elemento sensible al AMPc proteína de unión a CREB elemento cíclico sensible al AMP 8-(4-clorofeniltio)-cAMP hemaglutinina receptores de hormonas nucleares proteína quinasa A y C, respectivamente 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato elemento sensible al TPA Los factores de transcripción de la proteína de activación-1 (AP-1)1 son genes de respuesta temprana involucrados en un conjunto diverso de procesos reguladores transcripcionales. AP-1 es un complejo dimérico compuesto por miembros de las proteínas de la familia Fos y Jun (1Wisdom R. Exp. Cell Res. 1999; 253: 180-185Crossref PubMed Scopus (338) Google Scholar). Este complejo se une a la secuencia de ADN consenso TGA(G/C)TCA, denominada 12-O-tetradecanoilforbol-13-acetato (TPA) -elemento de respuesta (TRE) o AP-1, sitios que se encuentran en una variedad de promotores de genes, tales como factores de crecimiento, quimiocinas y citocinas (2Angel P. Imagawa M. Chiu R. Stein B. Imbra R.J. Rahmsdorf H.J. Jonat C. Herrlich P. Karin M. Cell. 1987; 49: 729-739Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (2155) Google Scholar). La familia Fos contiene cuatro proteínas (c-Fos, Fos-B, Fra-1 y Fra-2), mientras que la familia Jun se compone de tres (c-Jun, JunB y JunD). Fos y Jun son miembros del grupo básico de proteínas de la cremallera de leucina, y este motivo básico media la formación de homo y heterodímeros. c-Jun es el componente principal del complejo AP-1, y c-Fos es su socio más conocido (3Nishina H. Sato H. Suzuki T. Sato M. Iba H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1990; 87: 3619-3623Crossref PubMed Scopus (215) Google Scholar,4Angel P. Karin M. Biochim. Biophys. Acta. 1991; 1072: 129-157Crossref PubMed Scopus (3270) Google Scholar). La AP-1 es activada por mitógenos, oncoproteínas, citocinas y agentes de estrés como la luz ultravioleta. El éster de forbol TPA se utiliza a menudo para inducir la actividad de AP-1. La activación de esta proteína puede estar mediada tanto por mecanismos transcripcionalmente independientes como dependientes, que implican modificaciones postraduccionales de sus componentes o aumentos en la expresión de sus genes correspondientes, respectivamente (5Karin M. J. Biol. Chem. 1995; 270: 16483-16486Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2256) Google Scholar,6Karin M. Hunter T. Curr. Biol. 1995; 5: 747-757Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (666) Google Scholar). Los coactivadores de transcripción unen los factores de transcripción y los componentes del aparato transcripcional basal (7Horwitz K.B. Jackson t.a. Bain D.L. Richer J.K. Takimoto G.S. Tung I. Mol. Endocrinol. 1996; 10: 1167-1177Crossref PubMed Scopus (837) Google Scholar). Una clase importante de coactivadores incluye la proteína de unión al elemento de respuesta al AMPc (CREB) (CBP) y la proteína p300 altamente relacionada, que se identificaron originalmente por su capacidad para interactuar fuertemente con CREB (8Arias J. Alberts A.S. Brindle P. Claret F.X. Smeal T. Karin M. Feramisco J. Montminy M. Nature. 1994; 370: 226-229 Crossref PubMed Scopus (681) Google Scholar). Posteriormente, CBP y p300 se identificaron como cofactores esenciales para una serie de factores de transcripción nuclear, incluido el complejo AP-1 (9Albanese C. D'Amico M. Reutens A.T., Fu, M. Watanabe G. Lee R.J. Kitsis R.N. Henglein B. Avantaggiati M. Somasundaram K. Thimmapaya B. Pestell R.G. J. Biol. Chem. 1999; 274: 34186-34195Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (170) Google Scholar), varios componentes de la maquinaria transcripcional basal (TBP y TFIIB) (10Giordano A. Avantaggiati M.L. J. Cell. Physiol. 1999; 181: 218-230Crossref PubMed Scopus (256) Google Scholar), otras histona acetiltransferasas (SRC-1, actr y P/CAF) (11 Lee S. Kim H., Na, S. Kim T. Choi H., Im, S. Lee J.W. J. Biol. Chem. 1998; 273: 16651-16654Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (178) Google Scholar), proteínas del desarrollo (GATA-1, MEF-2, Pit-1) (12Liu S.L. Rand A. Kelm R.J., Jr. Getz M.J. Oncogene. 2000; 19: 3352-3362Crossref PubMed Scopus (18) Google Scholar), oncoproteínas virales (E1a, antígeno T grande e impuestos) (13Goodman R.H. Smolik S. Genes Dev. 2000; 14: 1553-1577PubMed Google Scholar), y receptores nucleares (14Lee S.K. Jung S.Y. Kim Y.S., Na, S.Y. Lee Y.C. Lee J.W. Mol. Endocrinol. 2001; 15: 241-254Crossref PubMed Scopus (44) Google Scholar). Estas proteínas coactivadoras son importantes no solo debido a su papel en la regulación transcripcional positiva de los sitios de unión al ADN, sino también debido a su papel como mediadores de la diafonía entre diferentes vías de transducción de señales (15Cheng X. Reginato M.J. Andrews N.C. Lazar M.A. Mol. Cell. Biol. 1997; 17: 1407-1416 Crossref PubMed Scopus (97) Google Scholar). Aunque se han descrito elementos de unión negativos, la represión se lleva a cabo principalmente por interferencia con otros factores de transcripción, de los cuales AP-1 es uno de los más representativos (16Saatcioglu F. Claret F.X. Karin M. Semin. Cancer Biol. 1994; 5: 347-359PubMed Google Scholar). Se ha informado que la CBP desempeña un papel significativo en la interferencia negativa entre los miembros de la familia de receptores nucleares, incluidos el receptor de glucocorticoides, el receptor de ácido retinoico, el receptor de hormona tiroidea y la actividad de AP-1, sin inhibición de la unión al ADN (17Kamei Y., Xu, L. Heinzel T. Torchia J. Kurokawa R. Gloss B. Lin S.C. Heyman R.A. Rose D. Glass C.K. Rosenfeld M.G. Cell. 1996; 85: 403-414Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1926) Google Scholar, 18Ko L. Cardona G.R. Chin W.W. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 6212-6217Crossref PubMed Scopus (128) Google Scholar, 19DiSepio D. Sutter M. Johnson A.T. Chandraratna R.A. Nagpal S. Mol. Cell Biol. Res. Commun. 1999; 1: 7-13 Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). Varios enfoques independientes revelaron que la CBP es necesaria para la activación tanto de AP-1 como de los receptores nucleares de hormonas (NHR). Como se ha sugerido, la competencia por limitar las cantidades de CBP puede explicar muchos de los efectos inhibidores de NHR sobre la activación de AP-1 (17Kamei Y., Xu, L. Heinzel T. Torchia J. Kurokawa R. Gloss B. Lin S.C. Heyman R.A. Rose D. Glass C.K. Rosenfeld M.G. Cell. 1996; 85: 403-414Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1926) Google Scholar, 20Mc Kenna N.J. Lanz R.B. O'Malley B.W. Endocr. Rev. 1999; 20: 321-344PubMed Google Scholar). Por lo tanto, en los genes que contienen sitios de unión a NHR pero que carecen de sitios de unión a AP-1, la regulación positiva por NHR ligado se inhibe mediante la activación de AP-1. Por el contrario, el NHR ligado puede inhibir la transcripción mediada por AP-1. En este artículo, presentamos un mecanismo distinto de diafonía negativa entre CREB y AP-1 que implica la competencia de CBP en la actividad transcripcional del promotor del gen de la 5-aminolevulinato sintasa (ALAS). ALAS es una enzima de matriz mitocondrial que cataliza el primer paso y limitante de la velocidad de la biosíntesis del hemo (21Kappas A. Sassa S. Galbraith R.A. Nordmann Y. Scriver C.R. Beaudet A.L. Sly W.S. Valle D. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Diseases. 7th Ed. McGraw-Hill Inc., Nueva York1995: 2103-2159Google Scholar). Hay dos isoenzimas ALAS relacionadas que están codificadas por dos genes separados ubicados en diferentes cromosomas. La enzima específica de células eritroides o ALAS-2 está regulada por el desarrollo y aumenta notablemente durante la eritropoyesis para satisfacer la demanda de hemo durante la producción de hemoglobina. La segunda enzima, ubicua o de tipo hepático ALAS (ALAS-1), probablemente se expresa en todos los tejidos para proporcionar hemo para citocromos y otras hemoproteínas (21Kappas A. Sassa S. Galbraith R.A. Nordmann Y. Scriver C.R. Beaudet A.L. Sly W.S. Valle D. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Diseases. 7th Ed. McGraw-Hill Inc., Nueva York 1995: 2103-2159Google Scholar, 22 de mayo B.K. Dogra S.C. Sadlon T.J. Bhasker C.R. Cox T.C. Bottomley S.S. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1995; 51: 1-51Crossref PubMed Scopus (123) Google Scholar). Se encontró que la expresión de ALAS en el hígado estaba sujeta a la regulación de retroalimentación por hemo (21Kappas A. Sassa S. Galbraith R.A. Nordmann Y. Scriver C.R. Beaudet A.L. Sly W.S. Valle D. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Diseases. 7th Ed. McGraw-Hill Inc., Nueva York1995: 2103-2159Google Scholar). Además de este importante mecanismo de regulación, hemos demostrado que el AMPc induce y los ésteres de forbol reprimen la expresión de las ALAS hepáticas a través de la activación de la proteína quinasa A (PKA) y la proteína quinasa C (PKC), respectivamente (23Varone C.L. Cánepa E.T. Arch. Biochem. Biophys. 1997; 341: 259-266Crossref PubMed Scopus (11) Google Scholar, 24Varone C.L. Giono L.E. Ochoa A. Zakin M.M. Cánepa E.T. Arch. Biochem. Biophys. 1999; 372: 261-270Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar). Los estudios realizados en la región reguladora 5'del gen ALAS mostraron la presencia de dos sitios funcionales similares a CRE que son necesarios no solo para la inducción mediada por cAMP sino también para la expresión basal. Estos sitios están limitados por CREB y reclutan el coactivador CBP (25Giono L.E. Varone C.L. Cánepa E.T. Biochem. J. 2001; 353: 307-316Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar). El propósito de este estudio fue examinar el mecanismo molecular subyacente a la expresión inhibida por TPA del gen ALAS. El análisis de deleción del promotor se realizó en el gen ALAS, que, como ya hemos demostrado, está reprimido por TPA (23Varone C.L. Cánepa E.T. Arch. Biochem. Biophys. 1997; 341: 259-266Crossref PubMed Scopus (11) Google Scholar). Descubrimos que un sitio de unión a AP-1 (TRE-ALAS) era crucial para la inhibición del promotor ALAS a pesar de su capacidad de respuesta positiva ampliamente informada a TPA en varios promotores (26Sakamoto S. Taniguchi T. J. Biol. Chem. 2001; 276: 37237-37241Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (20) Google Scholar, 27Simon C. Simon M. Vucelic G. Hicks M.J. Plinkert P.K. Koitschev A. Zenner H.P. Exp. Cell Res. 2001; 271: 344-355Crossref PubMed Scopus (105) Google Scholar). Los complejos heterodiméricos nucleares que se unen a TRE-ALAS estarían compuestos por c-Fos y c-Jun o c-Fos y JunD. Además, nuestros datos indican que la sobreexpresión de CBP alivió la represión de TPA, lo que sugiere que el secuestro de CBP evita la formación aguas abajo del complejo CREB·CBP necesario para la transcripción basal del gen ALAS. Esta competencia por limitar la cantidad intracelular de un coactivador común podría explicar el extraño efecto inhibidor de TPA sobre la expresión génica de ALAS. Finalmente, observamos diferentes respuestas al TPA dependiendo de la posición relativa de los sitios TRE y CRE en el promotor ALAS. Por lo tanto, el complejo AP-1 en TRE-ALAS interferiría de una manera dependiente de la disposición con la maquinaria de transcripción a través del secuestro de CBP durante la inhibición de la expresión génica de ALAS. El medio esencial mínimo de Eagle, isotiocianato de guanidina, TPA, 4α-forbol-12,13-diacetato (4αPDA), agarosa, calfostina C, cloranfenicol, butiril coenzima A, 8-CPT-cAMP, ando-nitrofenil-β-d-galactopiranósido se compraron a Sigma. [ring-3,5-3H]Cloranfenicol (actividad específica 1.1–2.2 GBq/mmol), [γ-32P]ATP (actividad específica 222 TBq/mmol) y [α-32P]dCTP (actividad específica 111 TBq/mmol) se compraron a PerkinElmer Life Sciences. El kit de cebadores aleatorios, las endonucleasas de restricción y las enzimas modificadoras de ADN fueron de New England Biolabs, Inc. Todos los demás productos químicos fueron de grado analítico. Los oligodesoxinucleótidos fueron sintetizados químicamente por Bio-Synthesis Inc. (Lewisville, TX). Los siguientes vectores de expresión se utilizaron como se indica en cada experimento. El plásmido pALAS/CAT contiene la región flanqueante 5'(-833 a +42 pb) del gen ALAS ubicuo de rata clonado cadena arriba del gen indicador CAT en el vector pBLCAT6. Los plásmidos mutantes de deleción P-459ALAS/CAT, P-354ALAS/CAT, P-156ALAS/CAT y p-75ALAS/CAT se describieron previamente (25Giono L.E. Varone C.L. Cánepa E.T. Biochem. J. 2001; 353: 307-316Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar). Los vectores pSG5 que codifican formas de tipo salvaje de c-Fos, c-Jun, JunB o JunD, y un vector pRc/RSV que codifica el ADNc para la versión de tipo salvaje de CBP fueron amablemente proporcionados por el Dr. P. Sassone-Corsi (Institut de Génétique et de Biologie Molé culaire et Cellulaire, Estrasburgo, Francia). El vector pCEFLp300 que codifica el ADNc para la versión de tipo salvaje de p300 fue un regalo del Dr. J. Silvio Gutkind (NIDCR, National Institutes of Health, Bethesda, MD). El pCMV/A-Fos (designado pA-Fos) es un vector de expresión impulsado por citomegalovirus en el que la región básica normal crítica para la unión al ADN en el extremo N de la cremallera de leucina Fos se reemplazó por una secuencia ácida (un generoso regalo del Dr. Charles Vinson, NCI, National Institutes of Health, Bethesda, MD) (28Olive M. Krylov D. Echlin D.R. Gardner K. Taparowsky E. Vinson C. J. Biol. Chem. 1997; 272: 18586-18594Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (243) Google Scholar). El plásmido pTRE-tk-CAT contiene dos secuencias consenso TRE aguas arriba del promotor de la timidina quinasa de HSV (29Icard-Liepkalns C. Biguet N.F. Vyas S. Robert J.J. Sassone-Corsi P. Mallet J.J. Neurosci. Res. 1992; 32: 290-298Crossref PubMed Scopus (105) Google Scholar). El vector pASCAT heterólogo, en el que se colocó una copia de la secuencia de -354a -156 pb del gen ALAS en dirección 5 'del promotor de timidina cinasa, se generó clonando el fragmento AflII/StuI de pACAT en el sitio SalI de pBLCAT2. De manera similar, los vectores pAECATd o pAECATi que contienen una copia de la secuencia de -354 a -38pb del gen ALAS en la posición derecha o invertida, respectivamente, aguas arriba del promotor de timidina cinasa se generaron clonando el fragmentoAflII/BstEII de pACAT en el sitio SalI de pBLCAT2. Las mutaciones se generaron mediante mutagénesis dirigida al sitio basada en la reacción en cadena de la polimerasa (Stratagene, La Jolla, CA). En los vectores p-354ALAS/CATm, pAECATdm y pAECATim, el sitio TRE-ALAS se mutó de TGACGCA de tipo salvaje (cadena codificante) a TGACGTG (cadena codificante). La fidelidad de todos los vectores mutados se comprobó mediante la secuencia de ADN. También se utilizó el plásmido pCEFL que contiene el gen de la β-galactosidasa. Para realizar los ensayos de transfección, los plásmidos se purificaron utilizando el WizardPlus Maxipreps (Promega Co). La concentración de ADN se estimó espectrofotométricamente. La línea celular de hepatoma humano HepG2 se cultivó como cultivos monocapa en medio esencial mínimo suplementado con 10% (v/v) de suero de ternera fetal inactivado por calor y 1% de penicilina-estreptomicina, 100 μm de aminoácidos no esenciales y 2 mm de glutamina. Las células se cultivaron en una atmósfera humidificada con CO2 al 5% a 37 °C. Para el análisis de ARN, se añadieron fenobarbital y TPA a las células HepG2 a una confluencia del 75% en placas de cultivo tisular de 100 mm para los tiempos y concentraciones detallados en las leyendas de las figuras. El fenobarbital se disolvió en 0.1 ml del medio correspondiente. Los ésteres de forbol y la calfostina C se disolvieron en un pequeño volumen (menos del 0,5% del volumen total de los medios de cultivo) de Me2SO. El ARN celular total se aisló de células HepG2 cultivadas de acuerdo con Chomczinsky y Sacchi (30Chomczinsky P. Sacchi N. Anal. Biochem. 1987; 71: 341-350Google Scholar). El rendimiento y la pureza de las muestras de ARN se evaluaron mediante la relación de absorbancia a 260 y 280 nm. Para el análisis de transferencia Northern, se desnaturalizaron 20 μg de ARN total, se sometieron a electroforesis en geles de glioxal-agarosa al 1% y se transfirieron a membranas de nylon (Hybond N,Amersham Biosciences). Las membranas se hibridaron secuencialmente con sondas marcadas con 32P a ALAS de hígado humano y β-tubulina. Para detectar el ARNm de ALAS, se sintetizó un oligodesoxinucleótido 26-mero complementario a las bases +328 a +353 del ARNm de ALAS ubicuo humano (31Bishop D.F. Nucleic Acids Res. 1990; 18: 7187-7188Crossref PubMed Scopus (50) Google Scholar). El oligodesoxinucleótido se purificó y se marcó en el extremo 5'usando [γ-32P]ATP y polinucleótido cinasa T4. La sonda resultante tenía una actividad específica de aproximadamente 5–6 × 103 cpm/fmol. La hibridación se llevó a cabo durante la noche a 70 °C en la misma solución de prehibridación añadiendo el oligodesoxinucleótido marcado con 32P (3.0 × 105 cpm/cm2) como se describió anteriormente (24Varone C.L. Giono L.E. Ochoa A. Zakin M.M. Cánepa E.T. Arch. Biochem. Biophys. 1999; 372: 261-270Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar). Para detectar el ARNm de β-tubulina, se marcó ADNc de β-tubulina de pollo (un generoso obsequio del Dr. J. Messina, Florida) mediante cebado aleatorio utilizando [α-32P]dCTP y Klenow a una actividad específica de aproximadamente 6 × 108 cpm/μg. Las membranas se despojaron, prehibridaron, hibridaron y lavaron en condiciones estándar descritas por Sambrook et ál. (32Sambrook, J., y Russell, D. W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., pp. 7.42–7.45 y 17.48–17.51, Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor, NYGoogle Scholar). Las autorradiografías se obtuvieron exponiendo estas transferencias a una película Kodak XAR-5 con una pantalla intensificadora durante 3–5 días a -70 °C. Las transfecciones transitorias de HepG2 se realizaron de acuerdo con el método estándar de precipitación con fosfato de calcio como se describió anteriormente (25Giono L.E. Varone C.L. Cánepa E.T. Biochem. J. 2001; 353: 307-316Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar). En resumen, se cotransfectaron 4 μg de pALAS/CAT o sus derivados y 6 μg de pCEFLβgal en 5 × 105 células sembradas en placas de Petri de 35 mm. El plásmido β-galactosidasa se utilizó como estándar interno para normalizar la eficacia de la transfección. El uso de otros plásmidos cotransfectados se indica en cada experimento. La cantidad de vectores de expresión Fos/Jun, CBP y p300 que se han utilizado en los diferentes experimentos se determinó previamente a través de curvas de dosis-respuesta. Se cotransfectaron diferentes cantidades de los plásmidos mencionados en células HepG2 junto con p-354ALAS/CAT, y se midió la expresión de CAT. La cantidad mínima de cada plásmido que produjo el efecto máximo se utilizó en experimentos posteriores. La concentración final de ADN se ajustó a 30 μg/placa de 35 mm con portador de ADN no específico. Las transfecciones de control con portador solo y portador más vector pBLCAT6 o pBLCAT2 se realizaron en paralelo. Dieciséis horas después, el medio se reemplazó con 3 ml de medio libre de suero que contenía los reactivos indicados en cada experimento y se incubó durante 24 h. Luego se recogieron las células y se midió la actividad de CAT en extractos celulares como se describió anteriormente (25Giono L.E. Varone C.L. Cánepa E.T. Biochem. J. 2001; 353: 307-316 Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar) de acuerdo con el método de extracción de fase Seed and Sheen (33Seed B. Sheen J.Y. Gene. 1988; 67: 271-277 Crossref PubMed Scopus (830) Google Scholar). La actividad de β-galactosidasa se determinó espectrofotométricamente en los extractos celulares transfectados (32Sambrook, J., y Russell, D. W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., pp. 7.42-7.45 y 17.48-17.51, Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor, NYGoogle Scholar). LA actividad de CAT se expresó como la cantidad de cloranfenicol radiomarcado acetilado por 1 mg de proteína en 1 min y se normalizó con la actividad de β-galactosidasa. La actividad de β-galactosidasa no se modificó por ninguno de los tratamientos utilizados. La concentración de proteína de los extractos celulares se determinó mediante el ensayo de Bradford (34Bradford M. Anal. Biochem. 1976; 72: 248-254Crossref PubMed Scopus (216391) Google Scholar). Se prepararon extractos nucleares a partir de células HepG2 estimuladas con TPA y no estimuladas como se describe por Andrews y Faller (35Andrews N.C. Faller D.V. Nucleic Acids Res. 1991; 19: 2499-2503Crossref PubMed Scopus (2211) Google Scholar). Las sondas de ADN bicatenario y los competidores fríos utilizados fueron TRE-ALAS (sitio AP-1 ubicado en -261 pb), 5'-AGGAGTCTGACGCACAGGGCT-3', y mutante, 5'-AGGAGTCTGACGTGCAGGGCT-3', llamado TRE-ALASmut, en el que las bases subrayadas se han mutado para alterar la unión específica de las proteínas de unión a AP-1. También se utilizó un oligodesoxinucleótido de control positivo que contenía un sitio de unión AP-1 consenso, 5'-CGCTTGATGAGTCAGCCGGAA-3', y un oligodesoxinucleótido que contenía un sitio CRE consenso correspondiente a los -58 a -31 pb del promotor del gen de somatostatina de rata 5'-AGAGATTGCCTGACGTCAGAGAGCTAG-3'. Los oligodesoxinucleótidos se marcaron en el extremo 5'con polinucleótido cinasa T4 y 222 TBq/mmol [γ-32P]dATP a 37 °C durante 60 min. Las reacciones de unión se realizaron mezclando 10 μg del extracto nuclear con 2 μg de poli(dI-dC) y 150,000 dpm de la sonda marcada en amortiguador TM (50 mm Tris-HCl, pH 7.9, 12.5 mm MgCl2, 1 mm EDTA, 1 mm ditiotreitol, 20% (v/v) glicerol) hasta un volumen final de 20 μl e incubado a temperatura ambiente durante 30 min. Cuando se observó, el extracto nuclear se incubó durante 20 min a temperatura ambiente en una mezcla de unión con el exceso molar indicado de ADN competidor no marcado antes de la adición de la sonda marcada. Después de la reacción de unión, se llevó a cabo la electroforesis a través de un gel de poliacrilamida no desnaturalizante al 5% que contenía 0,25× TBE (1× TBE: borato de Tris de 50 mm, pH 8,3, EDTA de 1 mm). A continuación, el gel se secó y se realizó una autorradiografía. El análisis de superdesplazamiento se realizó incubando el extracto nuclear con 3 μl de anticuerpo específico a 4 °C durante 4 h antes de los ensayos de desplazamiento de banda ya descritos. Los anticuerpos contra c-Fos, c-Jun y JunD se compraron en Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). Las células HepG2 se colocaron en placas de 100 mm (2 × 106) y se transfectaron con 2.5 μg de vector de expresión de CBP, donde CBP se etiquetó con HA, o el vector de la estructura principal utilizando el reactivo de transfección Escort de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Sigma). Dos días después de la transfección, se prepararon lisados celulares totales en tampón de ensayo de precipitación radioinmune (solución salina tamponada con fosfato 1x, Nonidet P-40 al 1%, desoxicolato de sodio al 0,5%, SDS al 0,1%, fluoruro de fenilmetilsulfonilo 10 μg/ml, aprotinina 60 μg/ml y ortovanadato de sodio 1 mm). Los lisados se centrifugaron a 10.000 × g durante 10 min para eliminar los residuos celulares. Los lisados aclarados (100 μg) se inmunoprecipitaron con anticuerpo monoclonal anti-HA (Santa Cruz). Los complejos inmunitarios se recuperaron en perlas de proteína A/G-agarosa (Santa Cruz) durante 1 h a 4 °C y luego se lavaron 4 veces con solución salina tamponada con fosfato. Las proteínas precipitadas se resuspendieron en tampón de muestra que contenía SDS al 2% y 30 mmβ-mercaptoetanol, se hirvieron durante 3 min, se fraccionaron mediante SDS-PAGE en un gel al 10% y después se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. A continuación, la membrana se inmunotransfirió con anti-fosfo-CREB policlonal anti-conejo (Cell Signaling Technology). El anticuerpo se detectó utilizando IgG anti-conejo de cabra ligada a peroxidasa de rábano picante (Sigma) y se visualizó mediante los sistemas de señalización de ultra-quimioluminiscencia Pierce Super Signal y un analizador de bioimagen Fujifilm LAS-1000. Para la inmunotransferencia directa de proteínas celulares, los lisados celulares totales de muestras paralelas se fraccionaron mediante electroforesis en SDS-PAGE en un gel al 10% y las proteínas se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. La proteína CREB se detectó utilizando el anticuerpo policlonal de conejo anti-CREB (señalización celular). Los complejos inmunitarios se visualizaron mediante quimioluminiscencia como se describió anteriormente. Primero estudiamos el efecto del TPA sobre la expresión del gen ALAS en células HepG2, ya sea en condiciones basales o inducidas. Estas células se incubaron con TPA de 1 μm durante hasta 24 h en presencia o ausencia de fenobarbital de 0,6 mm, un inductor bien conocido de la expresión génica ALAS (36Schuurmans M.M. Hoffmann F. Lindberg R.L. Meyer U.A. Hepatology. 2001; 33: 1217-1222 Crossref PubMed Scopus (21) Google Scholar). El análisis de transferencia Northern mostró que en ambos casos hubo una disminución dependiente del tiempo en los niveles de ARNm para ALAS, lo que sugiere que TPA inhibió la expresión génica de ALAS en células HepG2 (Fig. 1 A). La relación concentración-respuesta de TPA para la inhibición del ARNm de ALAS reveló un efecto dependiente de la dosis. El TPA fue eficaz en un intervalo de concentración de 10−8 a 10−5 m, y la inhibición máxima se alcanzó a 10−6 m y más (Fig. 1 B). Estos resultados concuerdan con lo observado anteriormente en cultivos primarios de hepatocitos de rata (23Varone C.L. Cánepa E.T. Arch. Biochem. Biophys. 1997; 341: 259-266Crossref PubMed Scopus (11) Google Scholar). Para determinar si las secuencias en la región flanqueante 5'del gen ALAS podrían conferir capacidad de respuesta a TPA, fusionamos aproximadamente 870 pb de esta región al gen indicador bacteriano para CAT. Las células HepG2 se transfectaron transitoriamente con este vector ALAS/CAT y luego se incubaron con diferentes cantidades de TPA antes de la recolección y el análisis de la actividad de CAT (Fig. 1 C). El TPA causó una inhibición dependiente de la dosis en la expresión de ALAS/CAT con una disminución máxima de casi 5 veces en las células no tratadas y 8 veces en las células expuestas a 0,6 mm de fenobarbital. La acción de 4αPDA, un análogo de TPA que es ineficaz en la promoción tumoral y la activación de PKC, se probó para excluir la posibilidad de un efecto inhibidor general debido a la incubación con ésteres de forbol. La adición de 1 μm4αPDA no logró reducir la expresión de ALAS/CAT (datos no mostrados). En muchos tipos de células, el tratamiento prolongado con ésteres de forbol dio como resultado un agotamiento casi completo de la PKC celular. Debido a que la activación de PKC condujo a la inhibición de la expresión génica de ALAS, las células HepG2 transfectadas transitoriamente con ALAS/CAT se pretrataron con 1 μm de TPA durante 12 h para determinar si la disminución de PKC por translocación a la membrana celular evitaba esta inhibición. Observamos que la estimulación prolongada de PKC resultó en el bloqueo de la inhibición de ALAS por TPA tanto en condiciones basales como estimuladas con fenobarbital (datos no mostrados). Además, la incubación de células HepG2 transfectadas con ALAS/CAT con 1 μm de calfostina C, un inhibidor de PKC, dio como resultado el bloqueo del efecto inhibidor de 1 μm de TPA sobre la actividad del promotor ALAS (Fig. 2). Estos resultados sugieren que la PKC está implicada en el efecto inhibidor de la expresión génica ALAS. Para identificar los elementos de respuesta que actúan sobre cis en la región flanqueante 5'del gen ALAS de rata que responden a TPA, se construyó una serie de mutantes de deleción progresivamente más largos de ALAS/CAT. Como en el caso de ALAS/CAT, estos mutantes del promotor de deleción se transfectaron transitoriamente en células HepG2 y se analizaron para determinar la actividad de CAT en ausencia y presencia de 1 μm de TPA. Como se muestra en la Fig. 3, la eliminación progresiva de secuencias de -833 a -354 pb no afectó significativamente la inhibición mediada por TPA de la actividad del promotor

Activation protein-1 (AP-1) transcription factors are early response genes involved in a diverse set of transcriptional regulatory processes. The phorbol ester 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) is often used to induce AP-1 activity. The purpose of this work was to explore the molecular mechanisms involved in the TPA regulation of ubiquitous 5-aminolevulinate synthase (ALAS) gene expression, the first and rate-controlling step of the heme biosynthesis. Previous analysis of the 5′-flanking sequence of ALAS revealed the existence of two cAMP-response elements (CRE) required for basal and cAMP-stimulated expression. The fragment −833 to +42 in the 5′-flanking region of rat ALAS gene was subcloned into a chloramphenicol acetyltransferase (CAT) reporter vector. The expression vector pALAS/CAT produced a significant CAT activity in transiently transfected HepG2 human hepatoma cells, which was repressed by TPA. Sequence and deletion analysis detected a TPA response element (TRE), located between −261 and −255 (TRE-ALAS), that was critical for TPA regulation. We demonstrated that c-Fos, c-Jun, and JunD are involved in TPA inhibitory effect due to their ability to bind TRE-ALAS, evidenced by supershift analysis and their capacity to repress promoter activity in transfection assays. Repression of ALAS promoter activity by TPA treatment or Fos/Jun overexpression was largely relieved when CRE protein-binding protein or p300 was ectopically expressed. When the TRE site was placed in a different context with respect to CRE sites, it appeared to act as a transcriptional enhancer. We propose that the decrease in ALAS basal activity observed in the presence of TPA may reflect a lower ability of this promoter to assemble the productive pre-initiation complex due to CRE protein-binding protein sequestration. We also suggest that the transcriptional properties of this AP-1 site would depend on a spatial-disposition-dependent manner with respect to the CRE sites and to the transcription initiation site. Activation protein-1 (AP-1) transcription factors are early response genes involved in a diverse set of transcriptional regulatory processes. The phorbol ester 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA) is often used to induce AP-1 activity. The purpose of this work was to explore the molecular mechanisms involved in the TPA regulation of ubiquitous 5-aminolevulinate synthase (ALAS) gene expression, the first and rate-controlling step of the heme biosynthesis. Previous analysis of the 5′-flanking sequence of ALAS revealed the existence of two cAMP-response elements (CRE) required for basal and cAMP-stimulated expression. The fragment −833 to +42 in the 5′-flanking region of rat ALAS gene was subcloned into a chloramphenicol acetyltransferase (CAT) reporter vector. The expression vector pALAS/CAT produced a significant CAT activity in transiently transfected HepG2 human hepatoma cells, which was repressed by TPA. Sequence and deletion analysis detected a TPA response element (TRE), located between −261 and −255 (TRE-ALAS), that was critical for TPA regulation. We demonstrated that c-Fos, c-Jun, and JunD are involved in TPA inhibitory effect due to their ability to bind TRE-ALAS, evidenced by supershift analysis and their capacity to repress promoter activity in transfection assays. Repression of ALAS promoter activity by TPA treatment or Fos/Jun overexpression was largely relieved when CRE protein-binding protein or p300 was ectopically expressed. When the TRE site was placed in a different context with respect to CRE sites, it appeared to act as a transcriptional enhancer. We propose that the decrease in ALAS basal activity observed in the presence of TPA may reflect a lower ability of this promoter to assemble the productive pre-initiation complex due to CRE protein-binding protein sequestration. We also suggest that the transcriptional properties of this AP-1 site would depend on a spatial-disposition-dependent manner with respect to the CRE sites and to the transcription initiation site. activation protein-1 4α-phorbol 12,13-diacetate 5-aminolevulinate synthase chloramphenicol acetyltransferase cAMP-responsive element protein CREB-binding protein cyclic AMP-responsive element 8-(4-chlorophenylthio)-cAMP hemagglutinin nuclear hormone receptors protein kinase A and C, respectively 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate TPA-responsive element Activation protein-1 (AP-1)1 transcription factors are early response genes involved in a diverse set of transcriptional regulatory processes. AP-1 is a dimeric complex composed of members of the Fos and Jun family proteins (1Wisdom R. Exp. Cell Res. 1999; 253: 180-185Crossref PubMed Scopus (338) Google Scholar). This complex binds the consensus DNA sequence TGA(G/C)TCA, termed 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate (TPA)-response element (TRE) or AP-1, sites found in a variety of promoters of genes, such as growth factors, chemokines, and cytokines (2Angel P. Imagawa M. Chiu R. Stein B. Imbra R.J. Rahmsdorf H.J. Jonat C. Herrlich P. Karin M. Cell. 1987; 49: 729-739Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (2155) Google Scholar). The Fos family contains four proteins (c-Fos, Fos-B, Fra-1, and Fra-2), whereas the Jun family is composed of three (c-Jun, JunB, and JunD). Fos and Jun are members of the basic leucine zipper group of proteins, and this basic motif mediates the formation of homo- and heterodimers. c-Jun is the major component of the AP-1 complex, and c-Fos is its best known partner (3Nishina H. Sato H. Suzuki T. Sato M. Iba H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1990; 87: 3619-3623Crossref PubMed Scopus (215) Google Scholar,4Angel P. Karin M. Biochim. Biophys. Acta. 1991; 1072: 129-157Crossref PubMed Scopus (3270) Google Scholar). AP-1 is activated by mitogens, oncoproteins, cytokines, and stress agents such as ultraviolet light. The phorbol ester TPA is often used to induce AP-1 activity. The activation of this protein may be mediated both by transcriptionally independent and dependent mechanisms, which involve post-translational modifications of its components or increases in the expression of their corresponding genes, respectively (5Karin M. J. Biol. Chem. 1995; 270: 16483-16486Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2256) Google Scholar,6Karin M. Hunter T. Curr. Biol. 1995; 5: 747-757Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (666) Google Scholar). Transcription coactivators bridge transcription factors and the components of the basal transcriptional apparatus (7Horwitz K.B. Jackson T.A. Bain D.L. Richer J.K. Takimoto G.S. Tung I. Mol. Endocrinol. 1996; 10: 1167-1177Crossref PubMed Scopus (837) Google Scholar). One important class of coactivators includes the cAMP-response element protein (CREB)-binding protein (CBP) and the highly related p300 protein, which were originally identified for their ability to interact strongly with CREB (8Arias J. Alberts A.S. Brindle P. Claret F.X. Smeal T. Karin M. Feramisco J. Montminy M. Nature. 1994; 370: 226-229Crossref PubMed Scopus (681) Google Scholar). Subsequently, CBP and p300 were identified as essential cofactors for a number of nuclear transcription factors, including AP-1 complex (9Albanese C. D'Amico M. Reutens A.T., Fu, M. Watanabe G. Lee R.J. Kitsis R.N. Henglein B. Avantaggiati M. Somasundaram K. Thimmapaya B. Pestell R.G. J. Biol. Chem. 1999; 274: 34186-34195Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (170) Google Scholar), several components of the basal transcriptional machinery (TBP and TFIIB) (10Giordano A. Avantaggiati M.L. J. Cell. Physiol. 1999; 181: 218-230Crossref PubMed Scopus (256) Google Scholar), other histone acetyltransferases (SRC-1, ACTR and P/CAF) (11Lee S. Kim H., Na, S. Kim T. Choi H., Im, S. Lee J.W. J. Biol. Chem. 1998; 273: 16651-16654Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (178) Google Scholar), developmental proteins (GATA-1, MEF-2, Pit-1) (12Liu S.L. Rand A. Kelm R.J., Jr. Getz M.J. Oncogene. 2000; 19: 3352-3362Crossref PubMed Scopus (18) Google Scholar), viral oncoproteins (E1A, large T antigen, and Tax) (13Goodman R.H. Smolik S. Genes Dev. 2000; 14: 1553-1577PubMed Google Scholar), and nuclear receptors (14Lee S.K. Jung S.Y. Kim Y.S., Na, S.Y. Lee Y.C. Lee J.W. Mol. Endocrinol. 2001; 15: 241-254Crossref PubMed Scopus (44) Google Scholar). These coactivator proteins are important not only due to their role in positive transcriptional regulation from DNA binding sites but also due to their role as mediators of cross-talk between different signal transduction pathways (15Cheng X. Reginato M.J. Andrews N.C. Lazar M.A. Mol. Cell. Biol. 1997; 17: 1407-1416Crossref PubMed Scopus (97) Google Scholar). Although negative binding elements have been described, repression is mainly conducted by interference with other transcription factors, of which AP-1 is one of the most representative (16Saatcioglu F. Claret F.X. Karin M. Semin. Cancer Biol. 1994; 5: 347-359PubMed Google Scholar). CBP has been reported to play a significant role in the negative cross-talk between members of the nuclear receptor family, including glucocorticoid receptor, retinoic acid receptor, thyroid hormone receptor, and AP-1 activity, without inhibition of DNA binding (17Kamei Y., Xu, L. Heinzel T. Torchia J. Kurokawa R. Gloss B. Lin S.C. Heyman R.A. Rose D. Glass C.K. Rosenfeld M.G. Cell. 1996; 85: 403-414Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1926) Google Scholar, 18Ko L. Cardona G.R. Chin W.W. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 6212-6217Crossref PubMed Scopus (128) Google Scholar, 19DiSepio D. Sutter M. Johnson A.T. Chandraratna R.A. Nagpal S. Mol. Cell Biol. Res. Commun. 1999; 1: 7-13Crossref PubMed Scopus (29) Google Scholar). Several independent approaches revealed that CBP is necessary for the activation of both AP-1 and of nuclear hormone receptors (NHR) as well. As has been suggested, competition for limiting amounts of CBP may account for many of the inhibitory effects of NHR on AP-1 activation (17Kamei Y., Xu, L. Heinzel T. Torchia J. Kurokawa R. Gloss B. Lin S.C. Heyman R.A. Rose D. Glass C.K. Rosenfeld M.G. Cell. 1996; 85: 403-414Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1926) Google Scholar, 20Mc Kenna N.J. Lanz R.B. O'Malley B.W. Endocr. Rev. 1999; 20: 321-344PubMed Google Scholar). Thus, on genes containing NHR binding sites but lacking AP-1 binding sites, positive regulation by liganded NHR is inhibited by activation of AP-1. Conversely, liganded NHR can inhibit AP-1-mediated transcription. In this paper, we present a distinct mechanism of negative cross-talk between CREB and AP-1 that involves competition by CBP on the transcriptional activity of 5-aminolevulinate synthase (ALAS) gene promoter. ALAS is a mitochondrial matrix enzyme that catalyzes the first and rate-limiting step of heme biosynthesis (21Kappas A. Sassa S. Galbraith R.A. Nordmann Y. Scriver C.R. Beaudet A.L. Sly W.S. Valle D. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Diseases. 7th Ed. McGraw-Hill Inc., New York1995: 2103-2159Google Scholar). There are two related ALAS isozymes that are encoded by two separate genes located on different chromosomes. The erythroid cell-specific enzyme or ALAS-2 is developmentally regulated, and it markedly increases during erythropoiesis to meet the demand for heme during hemoglobin production. The second enzyme, ubiquitous or liver type ALAS (ALAS-1), is probably expressed in all tissues to provide heme for cytochromes and other hemoproteins (21Kappas A. Sassa S. Galbraith R.A. Nordmann Y. Scriver C.R. Beaudet A.L. Sly W.S. Valle D. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Diseases. 7th Ed. McGraw-Hill Inc., New York1995: 2103-2159Google Scholar, 22May B.K. Dogra S.C. Sadlon T.J. Bhasker C.R. Cox T.C. Bottomley S.S. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 1995; 51: 1-51Crossref PubMed Scopus (123) Google Scholar). Expression of ALAS in the liver was found to be subject to feedback regulation by heme (21Kappas A. Sassa S. Galbraith R.A. Nordmann Y. Scriver C.R. Beaudet A.L. Sly W.S. Valle D. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Diseases. 7th Ed. McGraw-Hill Inc., New York1995: 2103-2159Google Scholar). In addition to this major mechanism of regulation, we have demonstrated that cAMP induces and phorbol esters repress the expression of liver ALAS through protein kinase A (PKA) and protein kinase C (PKC) activation, respectively (23Varone C.L. Cánepa E.T. Arch. Biochem. Biophys. 1997; 341: 259-266Crossref PubMed Scopus (11) Google Scholar, 24Varone C.L. Giono L.E. Ochoa A. Zakin M.M. Cánepa E.T. Arch. Biochem. Biophys. 1999; 372: 261-270Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar). Studies carried out on the 5′-regulatory region of ALAS gene showed the presence of two functional CRE-like sites that are necessary not only for the cAMP-mediated induction but also for basal expression. These sites are bounded by CREB and recruit coactivator CBP (25Giono L.E. Varone C.L. Cánepa E.T. Biochem. J. 2001; 353: 307-316Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar). The purpose of this study was to examine the molecular mechanism underlying TPA-inhibited expression of ALAS gene. Promoter deletion analysis were performed on the ALAS gene, which, as we have already demonstrated, is repressed by TPA (23Varone C.L. Cánepa E.T. Arch. Biochem. Biophys. 1997; 341: 259-266Crossref PubMed Scopus (11) Google Scholar). We found that an AP-1 binding site (TRE-ALAS) was crucial for the inhibition of the ALAS promoter despite its widely reported positive responsiveness to TPA in several promoters (26Sakamoto S. Taniguchi T. J. Biol. Chem. 2001; 276: 37237-37241Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (20) Google Scholar, 27Simon C. Simon M. Vucelic G. Hicks M.J. Plinkert P.K. Koitschev A. Zenner H.P. Exp. Cell Res. 2001; 271: 344-355Crossref PubMed Scopus (105) Google Scholar). The nuclear heterodimeric complexes that bind to TRE-ALAS would be composed of c-Fos and c-Jun or c-Fos and JunD. In addition, our data indicate that overexpression of CBP relieved TPA repression, suggesting that sequestration of CBP prevents the downstream formation of the CREB·CBP complex necessary for basal transcription of ALAS gene. This competition for limiting the intracellular amount of a common coactivator could explain the bizarre inhibitory effect of TPA on ALAS gene expression. Finally, we observed different responses to TPA depending on the relative position of TRE and CRE sites on the ALAS promoter. Therefore, AP-1 complex on TRE-ALAS would interfere in a disposition-dependent manner with the transcription machinery through CBP sequestration during the inhibition of ALAS gene expression. Eagle's minimum essential medium, guanidine isothiocyanate, TPA, 4α-phorbol-12,13-diacetate (4αPDA), agarose, calphostin C, chloramphenicol, butyryl coenzyme A, 8-CPT-cAMP, ando-nitrophenyl-β-d-galactopyranoside were purchased from Sigma. [ring-3,5-3H]Chloramphenicol (specific activity 1.1–2.2 GBq/mmol), [γ-32P]ATP (specific activity 222 TBq/mmol), and [α-32P]dCTP (specific activity 111 TBq/mmol) were purchased from PerkinElmer Life Sciences. Random primers kit, restriction endonucleases, and DNA modifying enzymes were from New England Biolabs, Inc. All other chemicals were of analytical grade. Oligodeoxynucleotides were chemically synthesized by Bio-Synthesis Inc. (Lewisville, TX). The following expression vectors were used as indicated in each experiment. Plasmid pALAS/CAT contains the 5′-flanking region (−833 to +42 bp) of rat ubiquitous ALAS gene cloned upstream the CAT reporter gene in vector pBLCAT6. Deletion mutant plasmids p-459ALAS/CAT, p-354ALAS/CAT, p-156ALAS/CAT, and p-75ALAS/CAT were described previously (25Giono L.E. Varone C.L. Cánepa E.T. Biochem. J. 2001; 353: 307-316Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar). Vectors pSG5 encoding wild type forms of c-Fos, c-Jun, JunB or JunD, and a pRc/RSV vector encoding the cDNA for the wild type version of CBP were kindly provided by Dr. P. Sassone-Corsi (Institut de Génétique et de Biologie Moléculaire et Cellulaire, Strasbourg, France). Vector pCEFLp300 encoding cDNA for the wild type version of p300 was a gift from Dr. J. Silvio Gutkind (NIDCR, National Institutes of Health, Bethesda, MD). The pCMV/A-Fos (designated pA-Fos) is a cytomegalovirus-driven expression vector in which the normal basic region critical for DNA binding at the N terminus of the Fos leucine zipper was replaced for an acidic sequence (a generous gift from Dr. Charles Vinson, NCI, National Institutes of Health, Bethesda, MD) (28Olive M. Krylov D. Echlin D.R. Gardner K. Taparowsky E. Vinson C. J. Biol. Chem. 1997; 272: 18586-18594Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (243) Google Scholar). The plasmid pTRE-tk-CAT contains two TRE consensus sequence upstream of the HSV thymidine kinase promoter (29Icard-Liepkalns C. Biguet N.F. Vyas S. Robert J.J. Sassone-Corsi P. Mallet J. J. Neurosci. Res. 1992; 32: 290-298Crossref PubMed Scopus (105) Google Scholar). The heterologous pASCAT vector, in which a copy of the −354 to −156-bp sequence of ALAS gene was placed upstream of the thymidine kinase promoter, was generated by cloning theAflII/StuI fragment of pACAT into theSalI site of pBLCAT2. Similarly, pAECATd or pAECATi vectors containing a copy of the −354 to −38-bp sequence of ALAS gene in the right or inverted position, respectively, upstream of the thymidine kinase promoter were generated by cloning theAflII/BstEII fragment of pACAT into theSalI site of pBLCAT2. The mutations were generated by polymerase chain reaction-based site-directed mutagenesis (Stratagene, La Jolla, CA). In p-354ALAS/CATm, pAECATdm, and pAECATim vectors the TRE-ALAS site was mutated from wild-type TGACGCA (coding strand) to TGACGTG (coding strand). The fidelity of all mutated vectors was checked by DNA sequence. Plasmid pCEFL containing the β-galactosidase gene was also used. To perform transfection assays, plasmids were purified using the WizardPlus Maxipreps (Promega Co). DNA concentration was estimated spectrophotometrically. The human hepatoma cell line HepG2 was grown as monolayer cultures in minimum essential medium supplemented with 10% (v/v) heat-inactivated fetal calf serum and 1% penicillin-streptomycin, 100 μm nonessential amino acids, and 2 mm glutamine. Cells were cultured in a humidified atmosphere with 5% CO2 at 37 °C. For RNA analysis, phenobarbital and TPA were added to HepG2 cells at 75% confluence in 100-mm tissue culture plates for the times and concentrations detailed in the figure legends. Phenobarbital was dissolved in 0.1 ml of the corresponding medium. Phorbol esters and calphostin C were dissolved in a small volume (less than 0.5% of the total volume of culture media) of Me2SO. Total cellular RNA was isolated from cultured HepG2 cells according to Chomczinsky and Sacchi (30Chomczinsky P. Sacchi N. Anal. Biochem. 1987; 71: 341-350Google Scholar). The yield and purity of RNA samples were assessed by the ratio of absorbance at 260 and 280 nm. For Northern blot analysis, 20 μg of total RNA were denatured, electrophoresed in 1% glyoxal-agarose gels, and transferred to nylon membranes (Hybond N,Amersham Biosciences). The membranes were sequentially hybridized with32P-labeled probes to human liver ALAS and β-tubulin. To detect ALAS mRNA, a 26-mer oligodeoxynucleotide was synthesized complementary to bases +328 to +353 of human ubiquitous ALAS mRNA (31Bishop D.F. Nucleic Acids Res. 1990; 18: 7187-7188Crossref PubMed Scopus (50) Google Scholar). The oligodeoxynucleotide was purified and 5′-end-labeled using [γ-32P]ATP and T4polynucleotide kinase. The resulting probe had a specific activity of about 5–6 × 103 cpm/fmol. Hybridization was carried out overnight at 70 °C in the same prehybridization solution by adding the 32P-labeled oligodeoxynucleotide (3.0 × 105 cpm/cm2) as previously described (24Varone C.L. Giono L.E. Ochoa A. Zakin M.M. Cánepa E.T. Arch. Biochem. Biophys. 1999; 372: 261-270Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar). To detect β-tubulin mRNA, chicken β-tubulin cDNA (a generous gift of Dr. J. Messina, Florida) was labeled by random priming using [α-32P]dCTP and Klenow to a specific activity of about 6 × 108 cpm/μg. Membranes were stripped, prehybridized, hybridized, and washed in standard conditions described by Sambrook et al. (32Sambrook, J., and Russell, D. W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., pp. 7.42–7.45 and 17.48–17.51, Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor, NYGoogle Scholar). Autoradiographs were obtained by exposing these blots to Kodak XAR-5 film with an intensifying screen for 3–5 days at −70 °C. HepG2 transient transfections were performed according to the standard calcium phosphate precipitation method as previously described (25Giono L.E. Varone C.L. Cánepa E.T. Biochem. J. 2001; 353: 307-316Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar). In brief, 4 μg of pALAS/CAT or its derivatives and 6 μg of pCEFLβgal were cotransfected into 5 × 105 cells plated on 35-mm Petri dishes. The β-galactosidase plasmid was used as the internal standard to normalize transfection efficacy. The use of other cotransfected plasmids is indicated in each experiment. The amount of Fos/Jun, CBP, and p300 expression vectors that have been used in the different experiments was previously determined through dose-response curves. Different quantities of the plasmids mentioned were co-transfected into HepG2 cells together with p-354ALAS/CAT, and CAT expression was measured. The minimum amount of each plasmid that produced the maximum effect was used in later experiments. Final DNA concentration was adjusted to 30 μg/35-mm dish with nonspecific DNA carrier. Control transfections with carrier alone and carrier plus vector pBLCAT6 or pBLCAT2 were done in parallel. Sixteen hours later, the medium was replaced with 3 ml of serum-free medium containing the reagents indicated in each experiment and incubated for 24 h. Then cells were collected, and CAT activity was measured in cell extracts as described previously (25Giono L.E. Varone C.L. Cánepa E.T. Biochem. J. 2001; 353: 307-316Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar) according to the Seed and Sheen phase-extraction method (33Seed B. Sheen J.Y. Gene. 1988; 67: 271-277Crossref PubMed Scopus (830) Google Scholar). The β-galactosidase activity was determined spectrophotometrically in the transfected cell extracts (32Sambrook, J., and Russell, D. W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., pp. 7.42–7.45 and 17.48–17.51, Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor, NYGoogle Scholar). CAT activity was expressed as the amount of radiolabeled chloramphenicol acetylated by 1 mg of protein in 1 min and normalized with β-galactosidase activity. β-Galactosidase activity was not modified by any of the treatments used. The protein concentration of the cell extracts was determined by the Bradford assay (34Bradford M. Anal. Biochem. 1976; 72: 248-254Crossref PubMed Scopus (216391) Google Scholar). Nuclear extracts were prepared from TPA-stimulated and unstimulated HepG2 cells as described by Andrews and Faller (35Andrews N.C. Faller D.V. Nucleic Acids Res. 1991; 19: 2499-2503Crossref PubMed Scopus (2211) Google Scholar). Double-strand DNA probes and cold competitors used were TRE-ALAS (AP-1 site located at −261 bp), 5′-AGGAGTCTGACGCACAGGGCT-3′, and mutant, 5′-AGGAGTCTGACGTGCAGGGCT-3′, called TRE-ALASmut, in which the underlined bases have been mutated to disrupt the specific binding of AP-1-binding proteins. A positive control oligodeoxynucleotide containing a consensus AP-1 binding site, 5′-CGCTTGATGAGTCAGCCGGAA-3′, and an oligodeoxynucleotide containing a consensus CRE site corresponding to the −58 to −31 bp of rat somatostatin gene promoter 5′-AGAGATTGCCTGACGTCAGAGAGCTAG-3′, were also used. Oligodeoxynucleotides were 5′-end-labeled with T4polynucleotide kinase and 222 TBq/mmol [γ-32P]dATP at 37 °C for 60 min. Binding reactions were performed mixing 10 μg of the nuclear extract with 2 μg of poly(dI-dC) and 150,000 dpm of the labeled probe in TM buffer (50 mm Tris-HCl, pH 7.9, 12.5 mm MgCl2, 1 mm EDTA, 1 mm dithiothreitol, 20% (v/v) glycerol) to a final volume of 20 μl and incubated at room temperature for 30 min. When noted, the nuclear extract was incubated for 20 min at room temperature in a binding mixture with the indicated molar excess of unlabeled competitor DNA before the addition of labeled probe. After the binding reaction, electrophoresis was carried out through a 5% non-denaturating polyacrylamide gel containing 0.25× TBE (1× TBE: 50 mmTris borate, pH 8.3, 1 mm EDTA). The gel was then dried, and autoradiography was performed. The supershift analysis was performed by incubating the nuclear extract with 3 μl of specific antibody at 4 °C for 4 h before the band shift assays already described. Antibodies against c-Fos, c-Jun, and JunD were purchased from Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). HepG2 cells were plated on 100-mm dishes (2 × 106) and transfected with 2.5 μg of CBP expression vector, where CBP was tagged with HA, or the backbone vector using Escort transfection reagent according to the recommendations of the manufacturer (Sigma). Two days after transfection, total cell lysates were prepared in radioimmune precipitation assay buffer (1× phosphate-buffered saline, 1% Nonidet P-40, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 10 μg/ml phenylmethylsulfonyl fluoride, 60 μg/ml aprotinin, and 1 mm sodium orthovanadate). The lysates were centrifuged at 10,000 × g for 10 min to remove cell debris. Cleared lysates (100 μg) were immunoprecipitated with monoclonal anti-HA antibody (Santa Cruz). The immune complexes were recovered on protein A/G-agarose beads (Santa Cruz) for 1 h at 4 °C and then washed 4 times with phosphate-buffered saline. The precipitated proteins were resuspended in sample buffer containing 2% SDS and 30 mmβ-mercaptoethanol, boiled for 3 min, fractionated by SDS-PAGE on a 10% gel, and thereafter blotted to a nitrocellulose membrane. The membrane was then immunoblotted with polyclonal anti-rabbit anti-phospho-CREB (Cell Signaling Technology). The antibody was detected using horseradish peroxidase-linked goat anti-rabbit IgG (Sigma) and visualized by the Pierce Super Signal Ultra Chemiluminescence signaling systems and a Bio-Imaging Analyzer Fujifilm LAS-1000. For direct immunoblotting of cell proteins, total cell lysates of parallel samples were fractionated by electrophoresis in SDS-PAGE on a 10% gel, and the proteins were transferred to a nitrocellulose membrane. Protein CREB was detected using the rabbit polyclonal antibody anti-CREB (Cell Signaling). The immune complexes were visualized by chemiluminescence as describe above. We first studied the effect of TPA on the expression of ALAS gene in HepG2 cells either in basal or induced conditions. These cells were incubated with 1 μm TPA for up to 24 h in the presence or the absence of 0.6 mm phenobarbital, a well known inducer of ALAS gene expression (36Schuurmans M.M. Hoffmann F. Lindberg R.L. Meyer U.A. Hepatology. 2001; 33: 1217-1222Crossref PubMed Scopus (21) Google Scholar). Northern blot analysis showed that in both cases there was a time-dependent decrease in mRNA levels for ALAS, suggesting that TPA inhibited ALAS gene expression in HepG2 cells (Fig. 1 A). The TPA concentration-response relationship for ALAS mRNA inhibition revealed a dose-dependent effect. TPA was effective over a concentration range of 10−8 to 10−5m, and maximum inhibition was reached at 10−6m and over (Fig. 1 B). These results agree with previous observations made in primary cultures of rat hepatocytes (23Varone C.L. Cánepa E.T. Arch. Biochem. Biophys. 1997; 341: 259-266Crossref PubMed Scopus (11) Google Scholar). To determine whether sequences in the 5′-flanking region of the ALAS gene could confer TPA responsiveness, we fused about 870 bp of this region to the bacterial reporter gene for CAT. HepG2 cells were transiently transfected with this ALAS/CAT vector and then incubated with different amounts of TPA before harvesting and analysis of CAT activity (Fig. 1 C). TPA caused a dose-dependent inhibition in ALAS/CAT expression with a maximum decrease of almost 5-fold in untreated cells and 8-fold in cells exposed to 0.6 mm phenobarbital. The action of 4αPDA, a TPA analog that is ineffective in tumor promotion and PKC activation, was tested to exclude the possibility of a general inhibitory effect due to incubation with phorbol esters. The addition of 1 μm4αPDA failed to reduce ALAS/CAT expression (data not shown). In many cell types, prolonged treatment with phorbol esters resulted in almost complete depletion of cellular PKC. Because PKC activation led to inhibition of ALAS gene expression, HepG2 cells transiently transfected with ALAS/CAT were pretreated with 1 μm TPA for 12 h to determine whether PKC diminution by translocation to the cell membrane prevented this inhibition. We observed that prolonged PKC stimulation resulted in the blockage of ALAS inhibition by TPA both in basal and phenobarbital-stimulated conditions (data not shown). Furthermore, incubation of ALAS/CAT-transfected HepG2 cells with 1 μm calphostin C, a PKC inhibitor, resulted in the blockage of the inhibitory effect of 1 μm TPA on ALAS promoter activity (Fig. 2). These results suggest that PKC is involved in the inhibitory effect of ALAS gene expression. To identifycis-acting response elements in the 5′-flanking region of the rat ALAS gene that are TPA-responsive, a series of progressively longer deletion mutants of ALAS/CAT were constructed. As in the case of ALAS/CAT, these deletion promoter mutants were transiently transfected into HepG2 cells and assayed for CAT activity in the absence and presence of 1 μm TPA. As shown in Fig. 3, progressive deletion of sequences from −833 to −354 bp did not significantly impair TPA-mediated inhibition of promoter acti

عوامل النسخ لبروتين التنشيط-1 (AP -1) هي جينات الاستجابة المبكرة المشاركة في مجموعة متنوعة من العمليات التنظيمية للنسخ. غالبًا ما يستخدم إستر فوربول 12 - O - tetradecanoylphorbol -13 - acetate (TPA) للحث على نشاط AP -1. كان الغرض من هذا العمل هو استكشاف الآليات الجزيئية المشاركة في تنظيم TPA للتعبير الجيني 5 - aminolevulinate synthase (للأسف) في كل مكان، وهي الخطوة الأولى والتحكم في معدل التخليق الحيوي للهيم. كشف التحليل السابق للتسلسل المحاط بـ 5بوصات من للأسف عن وجود عنصرين للاستجابة للتخييم (CRE) مطلوبين للتعبير الأساسي والتعبير المحفز للتخييم. تم استنساخ الجزء -833 إلى +42 في المنطقة المحيطة 5بوصة من جين الفئران للأسف في ناقل مراسل أسيتيل ترانسفيراز الكلورامفينيكول (CAT). أنتج التعبير المتجه pALAS/CAT نشاطًا كبيرًا للقطط في خلايا الورم الكبدي البشري المنقولة عابرًا HepG2، والتي تم قمعها بواسطة TPA. كشف تحليل التسلسل والحذف عن عنصر استجابة TPA (TRE)، الموجود بين −261 و −255 (TRE - ALAS)، والذي كان حاسمًا لتنظيم TPA. لقد أظهرنا أن c - Fos و c - Jun و JunD يشاركون في التأثير المثبط لـ TPA بسبب قدرتهم على ربط TRE - ALAS، كما يتضح من تحليل التحول الفائق وقدرتهم على قمع نشاط المروج في فحوصات نقل العدوى. تم تخفيف قمع نشاط المحفز للأسف عن طريق علاج TPA أو Fos/Jun overexpression إلى حد كبير عندما تم التعبير عن بروتين CRE المرتبط بالبروتين أو p300 خارج الرحم. عندما تم وضع موقع TRE في سياق مختلف فيما يتعلق بمواقع CRE، بدا أنه يعمل كمحسن نصي. نقترح أن الانخفاض في النشاط القاعدي للأسف الذي لوحظ في وجود TPA قد يعكس قدرة أقل لهذا المحفز على تجميع مجمع ما قبل البدء الإنتاجي بسبب عزل البروتين المرتبط بالبروتين CRE. نقترح أيضًا أن خصائص النسخ لموقع AP -1 هذا ستعتمد على طريقة تعتمد على الترتيب المكاني فيما يتعلق بمواقع CRE وموقع بدء النسخ. عوامل النسخ لبروتين التنشيط-1 (AP -1) هي جينات الاستجابة المبكرة المشاركة في مجموعة متنوعة من العمليات التنظيمية للنسخ. غالبًا ما يستخدم إستر فوربول 12 - O - tetradecanoylphorbol -13 - acetate (TPA) للحث على نشاط AP -1. كان الغرض من هذا العمل هو استكشاف الآليات الجزيئية المشاركة في تنظيم TPA للتعبير الجيني 5 - aminolevulinate synthase (للأسف) في كل مكان، وهي الخطوة الأولى والتحكم في معدل التخليق الحيوي للهيم. كشف التحليل السابق للتسلسل المحاط بـ 5بوصات من للأسف عن وجود عنصرين للاستجابة للتخييم (CRE) مطلوبين للتعبير الأساسي والتعبير المحفز للتخييم. تم استنساخ الجزء -833 إلى +42 في المنطقة المحيطة 5بوصة من جين الفئران للأسف في ناقل مراسل أسيتيل ترانسفيراز الكلورامفينيكول (CAT). أنتج التعبير المتجه pALAS/CAT نشاطًا كبيرًا للقطط في خلايا الورم الكبدي البشري المنقولة عابرًا HepG2، والتي تم قمعها بواسطة TPA. كشف تحليل التسلسل والحذف عن عنصر استجابة TPA (TRE)، الموجود بين −261 و −255 (TRE - ALAS)، والذي كان حاسمًا لتنظيم TPA. لقد أظهرنا أن c - Fos و c - Jun و JunD يشاركون في التأثير المثبط لـ TPA بسبب قدرتهم على ربط TRE - ALAS، كما يتضح من تحليل التحول الفائق وقدرتهم على قمع نشاط المروج في فحوصات نقل العدوى. تم تخفيف قمع نشاط المحفز للأسف عن طريق علاج TPA أو Fos/Jun overexpression إلى حد كبير عندما تم التعبير عن بروتين CRE المرتبط بالبروتين أو p300 خارج الرحم. عندما تم وضع موقع TRE في سياق مختلف فيما يتعلق بمواقع CRE، بدا أنه يعمل كمحسن نصي. نقترح أن الانخفاض في النشاط القاعدي للأسف الذي لوحظ في وجود TPA قد يعكس قدرة أقل لهذا المحفز على تجميع مجمع ما قبل البدء الإنتاجي بسبب عزل البروتين المرتبط بالبروتين CRE. نقترح أيضًا أن خصائص النسخ لموقع AP -1 هذا ستعتمد على طريقة تعتمد على الترتيب المكاني فيما يتعلق بمواقع CRE وموقع بدء النسخ. activation protein -1 4 α - phorbol 12,13 - diacetate 5 - aminolevulinate synthase chloramphenicol acetyltransferase cAMP - response element protein CREB - binding protein cyclic AMP - responsive element 8 -(4 - chlorophenylthio) - cAMP hemagglutininin nuclear hormone receptors protein kinase A and C, respectively 12 - O - tetradecanoylphorbol -13 - acetate TPA - responsive element activation protein -1 (AP -1)1 هي جينات استجابة مبكرة تشارك في مجموعة متنوعة من العمليات التنظيمية للنسخ. AP -1 عبارة عن مركب ثنائي الأبعاد يتكون من أعضاء من بروتينات عائلة Fos و Jun (1Wisdom R. Exp. Cell Res. 1999; 253: 180-185 Crossref PubMed Scopus (338) Google Scholar). يربط هذا المركب تسلسل الحمض النووي بالإجماع TGA(G/C)TCA، المسمى عنصر استجابة 12 - O - tetradecanoylphorbol -13 - acetate (TPA) أو AP -1، والمواقع الموجودة في مجموعة متنوعة من محفزات الجينات، مثل عوامل النمو والكيموكينات والسيتوكينات (2Angel P. Imagawa M. Chiu R. Stein B. Imbra RJ Rahmsdorf H.J. Jonat C. Herrlich P. Karin M. Cell. 1987 ؛ 49: 729-739 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (2155) الباحث العلمي من Google). تحتوي عائلة Fos على أربعة بروتينات (c - Fos و Fos - B و Fra -1 و Fra -2)، في حين تتكون عائلة Jun من ثلاثة (c - Jun و JunB و JunD). Fos و Jun هما عضوان في مجموعة البروتينات الأساسية لسحاب leucine، وهذا الحافز الأساسي يتوسط تكوين homo - و heterodimers. c - Jun هو المكون الرئيسي لمركب AP -1، و c - Fos هو شريكها الأكثر شهرة (3Nishina H. Sato H. Suzuki T. Sato M. Iba H. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1990; 87: 3619-3623 Crossref PubMed Scopus (215) Google Scholar ,4AngelP. Karin M. Biochim. Biophys. Acta. 1991 ؛ 1072: 129-157 Crossref PubMed Scopus (3270) Google Scholar). يتم تنشيط AP -1 بواسطة الميتوجينات والبروتينات الورمية والسيتوكينات وعوامل الإجهاد مثل الأشعة فوق البنفسجية. غالبًا ما يستخدم استير الفوربول TPA للحث على نشاط AP -1. يمكن التوسط في تنشيط هذا البروتين من خلال آليات مستقلة وتابعة للنسخ، والتي تنطوي على تعديلات ما بعد الترجمة لمكوناته أو زيادات في التعبير عن جيناتهم المقابلة، على التوالي (5Karin MJ Biol. Chem. 1995; 270: 16483-16486 Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (2256) Google Scholar ,6Karin M. Hunter T. Curr. بيول. 1995 ؛ 5: 747-757 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (666) الباحث العلمي من Google). تعمل مشغلات النسخ على ربط عوامل النسخ ومكونات جهاز النسخ الأساسي (7Horwitz KB Jackson TA Bain D.L. Richer J.K. Takimoto G.S. Tung I. Mol. الغدد الصماء. 1996 ؛ 10: 1167-1177 Crossref PubMed Scopus (837) الباحث العلمي من Google). تشمل إحدى الفئات المهمة من المنشطات بروتين عنصر الاستجابة للتخييم (CREB) - البروتين الملزم (CBP) وبروتين p300 ذي الصلة الشديدة، والتي تم تحديدها في الأصل لقدرتها على التفاعل بقوة مع CREB (8Arias J. Alberts A.S. Brindle P. Claret F.X. Smeal T. Karin M. Feramisco J. Montminy M. Nature. 1994 ؛ 370: 226-229 Crossref PubMed Scopus (681) الباحث العلمي من Google). في وقت لاحق، تم تحديد CBP و p300 كعوامل مساعدة أساسية لعدد من عوامل النسخ النووي، بما في ذلك مجمع AP -1 (9 Albanese C. D'Amico M. Reutens A.T.، Fu، M. Watanabe G. Lee RJ Kitsis R.N. Henglein B. Avantaggiati M. Somasundaram K. Thimmapaya B. Pestell RG J. Biol. Chem. 1999; 274: 34186-34195Abstract full text full text PDF PubMed Scopus (170) Google Scholar), several components of the basal transcriptional machinery (TBP and TFIIB) (10Giordano A. Avantaggiati M.L. J Cell. Physiol. 1999; 181: 218-230 Crossref PubMed Scopus (256) Google Scholar), other histone acetyltransferases (SRC -1, ACTR and P/CAF) (11Lee S. Kim H., Na, S. Kim T. Choi H., Im, S. Lee J.W. J. Biol. Chem. 1998; 273: 16651-16654 Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (178) Google Scholar), developmental proteins (GATA -1, MEF -2, Pit -1) (12Liu S.L. Rand A. Kelm R.J., Jr. Getz M.J. Oncogene. 2000 ؛ 19: 3352-3362 Crossref PubMed Scopus (18) الباحث العلمي من Google)، البروتينات الورمية الفيروسية (E1A، مستضد T كبير، والضريبة) (13Goodman RH Smolik S. Genes Dev. 2000 ؛ 14: 1553-1577 عالم جوجل بوب ميد)، والمستقبلات النووية (14Lee S.K. Jung S.Y. Kim Y.S., Na, S.Y. Lee Y.C. Lee J.W. Mol. الغدد الصماء. 2001 ؛ 15: 241-254 Crossref PubMed Scopus (44) الباحث العلمي من Google). هذه البروتينات المنشطة مهمة ليس فقط بسبب دورها في تنظيم النسخ الإيجابي من مواقع ربط الحمض النووي ولكن أيضًا بسبب دورها كوسيط للتحدث المتبادل بين مسارات نقل الإشارة المختلفة (15Cheng X. Reginato M.J. Andrews N.C. Lazar M.A. Mol. الخلية. بيول. 1997 ؛ 17: 1407-1416 Crossref PubMed Scopus (97) الباحث العلمي من Google). على الرغم من وصف عناصر الربط السلبية، إلا أن القمع يتم بشكل أساسي عن طريق التدخل في عوامل النسخ الأخرى، والتي يعد AP -1 أحد أكثرها تمثيلاً (16Saatcioglu F. Claret F.X. Karin M. Semin. Cancer Biol. 1994; 5: 347-359 PubMed Google Scholar). تم الإبلاغ عن أن CBP يلعب دورًا مهمًا في التشويش السلبي بين أعضاء عائلة المستقبلات النووية، بما في ذلك مستقبلات الجلوكوكورتيكويد ومستقبلات حمض الريتينويك ومستقبلات هرمون الغدة الدرقية ونشاط AP -1، دون تثبيط ارتباط الحمض النووي (17Kamei Y.، Xu، L. Heinzel T. Torchia J. Kurokawa R. Gloss B. Lin S.C. Heyman R.A. Rose D. Glass C.K. Rosenfeld M.G. Cell. 1996; 85: 403-414 Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (1926) Google Scholar, 18Ko L. Cardona G.R. Chin W.W. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 6212-6217 Crossref PubMed Scopus (128) Google Scholar, 19DiSepio D. Sutter M. Johnson A.T. Chandraratna R.A. Nagpal S. Mol. Cell Biol. Res. Commun. 1999 ؛ 1: 7-13 Crossref PubMed Scopus (29) الباحث العلمي من Google). كشفت العديد من الأساليب المستقلة أن إدارة الجمارك وحماية الحدود ضرورية لتنشيط كل من AP -1 ومستقبلات الهرمونات النووية (NHR) أيضًا. كما تم اقتراحه، قد تمثل المنافسة على الحد من كميات CBP العديد من التأثيرات المثبطة لـ NHR على تنشيط AP -1 (17Kamei Y.، Xu، L. Heinzel T. Torchia J. Kurokawa R. Gloss B. Lin S.C. Heyman R.A. Rose D. Glass C.K. Rosenfeld M.G. Cell. 1996 ؛ 85: 403-414 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (1926) الباحث العلمي من Google، 20Mc Kenna N.J. Lanz R.B. O'Malley B.W. Endocr. مراجعة. 1999 ؛ 20: 321-344 PubMed الباحث العلمي من Google). وبالتالي، في الجينات التي تحتوي على مواقع ربط NHR ولكنها تفتقر إلى مواقع ربط AP -1، يتم تثبيط التنظيم الإيجابي بواسطة NHR المرتبط عن طريق تنشيط AP -1. على العكس من ذلك، يمكن أن تمنع NHR المربوطة النسخ بوساطة AP -1. في هذه الورقة، نقدم آلية متميزة للحديث المتبادل السلبي بين CREB و AP -1 التي تنطوي على منافسة من قبل CBP على النشاط النصي لمروج الجينات 5 - aminolevulinate synthase (للأسف). للأسف هو إنزيم مصفوفة الميتوكوندريا الذي يحفز الخطوة الأولى والمحددة للمعدل للتخليق الحيوي للهيم (21Kappas A. Sassa S. Galbraith R.A. Nordmann Y. Scriver C.R. Beaudet A.L. Sly W.S. Valle D. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Diseases. 7th Ed. McGraw - Hill Inc.، نيويورك 1995: 2103-2159 الباحث العلمي من Google). هناك نوعان من الأيزوزيمات المرتبطة التي يتم ترميزها بواسطة جينين منفصلين يقعان على كروموسومات مختلفة. يتم تنظيم الإنزيم الخاص بخلايا الكريات الحمر أو ALAS -2 من الناحية التنموية، ويزداد بشكل ملحوظ أثناء تكون الكريات الحمر لتلبية الطلب على الهيموغلوبين أثناء إنتاج الهيموغلوبين. ربما يتم التعبير عن الإنزيم الثاني، في كل مكان أو نوع الكبد للأسف (ALAS -1)، في جميع الأنسجة لتوفير الهيم للكرومات الخلوية والبروتينات الدموية الأخرى (21Kappas A. Sassa S. Galbraith R.A. Nordmann Y. Scriver C.R. Beaudet A.L. Sly W.S. Valle D. The Metabolic and Molecular Basis of Inherited Diseases. 7th Ed. McGraw - Hill Inc.، New York 1995: 2103-2159 Google Scholar، 22 May B.K. Dogra S.C. Sadlon T.J. Bhasker C.R. Cox T.C. Bottomley S.S. Prog. حمض نووي Res. Mol. بيول. 1995 ؛ 51: 1-51 Crossref PubMed Scopus (123) الباحث العلمي من Google). تبين أن التعبير عن الأسف في الكبد يخضع لتنظيم التغذية الراجعة من قبل HEME (21Kappas A. Sassa S. Galbraith R.A. Nordmann Y. Scriver C.R. Beaudet A.L. Sly W.S. Valle D. الأساس الأيضي والجزيئي للأمراض الموروثة. الطبعة السابعة. McGraw - Hill Inc.، نيويورك 1995: 2103-2159 الباحث العلمي من Google). بالإضافة إلى هذه الآلية الرئيسية للتنظيم، أثبتنا أن cAMP يحفز وإسترات الفوربول تقمع تعبير الكبد للأسف من خلال تنشيط البروتين كيناز A (PKA) والبروتين كيناز C (PKC)، على التوالي (23Varone C.L. Cañnepa E.T. Arch. Biochem. Biophys. 1997; 341: 259-266 Crossref PubMed Scopus (11) Google Scholar, 24Varone C.L. Giono L.E. Ochoa A. Zakin M.M. Cánepa E.T. Arch. Biochem. Biophys. 1999; 372: 261-270 Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar). أظهرت الدراسات التي أجريت على المنطقة التنظيمية 5'للجين للأسف وجود موقعين وظيفيين شبيهين بـ CRE ضروريين ليس فقط للتحريض بوساطة المخيم ولكن أيضًا للتعبير الأساسي. وتحد هذه المواقع CREB وتجنيد المتعاونين CBP (25Giono L.E. Varone C.L. CañnepaE.T. Biochem. J. 2001 ؛ 353: 307-316 Crossref PubMed Scopus (26) الباحث العلمي من Google). كان الغرض من هذه الدراسة هو فحص الآلية الجزيئية الكامنة وراء التعبير المثبط لـ TPA لجين للأسف. تم إجراء تحليل حذف المروج على جين للأسف، والذي، كما أوضحنا بالفعل، يتم قمعه بواسطة TPA (23Varone C.L. Cañnepa E.T. Arch. Biochem. Biophys. 1997; 341: 259-266 Crossref PubMed Scopus (11) Google Scholar). وجدنا أن موقع ربط AP -1 (TRE - ALAS) كان حاسمًا لتثبيط مروج ALAS على الرغم من استجابته الإيجابية المبلغ عنها على نطاق واسع لـ TPA في العديد من المروجين (26Sakamoto S. Taniguchi TJ Biol. Chem. 2001; 276: 37237-37241Abstract full text full text PDF PubMed Scopus (20) Google Scholar, 27Simon C. Simon M. Vucelic G. Hicks M.J. Plinkert P.K. Koitschev A. Zenner H.P. Exp. Cell Res. 2001; 271: 344-355 Crossref PubMed Scopus (105) Google Scholar). ستتكون المجمعات الثنائية غير المتجانسة النووية التي ترتبط بـ TRE - ALAS من c - Fos و c - Jun أو c - Fos و JunD. بالإضافة إلى ذلك، تشير بياناتنا إلى أن الإفراط في التعبير عن CBP خفف من قمع TPA، مما يشير إلى أن عزل CBP يمنع التكوين النهائي لمركب CREB·CBP الضروري للنسخ الأساسي لجين ALAS. يمكن أن تفسر هذه المنافسة للحد من الكمية داخل الخلايا من المنشط المشترك التأثير المثبط الغريب لـ TPA على التعبير الجيني للأسف. أخيرًا، لاحظنا استجابات مختلفة لـ TPA اعتمادًا على الموقع النسبي لمواقع TRE و CRE على مروج ALAS. لذلك، فإن مركب AP -1 على TRE - ALAS سيتداخل بطريقة تعتمد على التصرف مع آلية النسخ من خلال عزل CBP أثناء تثبيط التعبير الجيني للأسف. تم شراء الحد الأدنى من الوسط الأساسي للنسر، جوانيدين إيزوثيوسيانات، TPA، 4 α -فوربول-12، 13 - داياسيتات (4 αPDA)، أجاروز، كالفوستين C، كلورامفينيكول، إنزيم بوتيريل المساعد A، 8 - CPT - cAMP، ando - nitrophenyl - β - d - galactopyranoside من Sigma. [حلقة-3، 5-3 H] تم شراء الكلورامفينيكول (نشاط محدد 1.1-2.2 GBq/mmol)، [γ -32P] ATP (نشاط محدد 222 TBq/mmol)، و [α -32P] dCTP (نشاط محدد 111 TBq/mmol) من PerkinElmer Life Sciences. كانت مجموعة المواد الأولية العشوائية، والأنزيمات الداخلية المقيدة، والإنزيمات المعدلة للحمض النووي من New England Biolabs، Inc. وكانت جميع المواد الكيميائية الأخرى ذات درجة تحليلية. تم تصنيع Oligodeoxynucleotides كيميائيًا بواسطة Bio - Synthesis Inc. (Lewisville، TX). تم استخدام متجهات التعبير التالية كما هو موضح في كل تجربة. يحتوي البلازميد pALAS/CAT على المنطقة المحيطة 5بوصة (-833 إلى +42 نقطة أساس) من جين الفئران المنتشر في كل مكان المستنسخ في المنبع من جين مراسل CAT في ناقل pBLCAT6. تم وصف البلازميدات المتحولة للحذف p -459ALAS/CAT و p -354ALAS/CAT و p -156ALAS/CAT و p -75ALAS/CAT سابقًا (25Giono L.E. Varone C.L. Cañnepa E.T. Biochem. J. 2001 ؛ 353: 307-316 Crossref PubMed Scopus (26) الباحث العلمي من Google). تم توفير ناقلات pSG5 التي تشفر أشكال النوع البري من c - Fos أو c - Jun أو JunB أو JunD، وناقل pRc/RSV الذي يشفر cDNA لإصدار النوع البري من CBP من قبل الدكتور P. Sassone- Corsi (معهد الهندسة والبيولوجيا الخلوية والخلوية، ستراسبورغ، فرنسا). كان Vector pCEFLp300 ترميز cDNA للنسخة البرية من p300 هدية من الدكتور J. Silvio Gutkind (NIDCR، المعاهد الوطنية للصحة، بيثيسدا، دكتوراه في الطب). إن pCMV/A - Fos (المعين pA - Fos) هو ناقل تعبير يحركه الفيروس المضخم للخلايا حيث تم استبدال المنطقة الأساسية الطبيعية الحرجة لربط الحمض النووي عند الطرف N لسحاب Fos leucine لتسلسل حمضي (هدية سخية من الدكتور تشارلز فينسون، NCI، المعاهد الوطنية للصحة، بيثيسدا، دكتوراه في الطب) (28Olive M. Krylov D. Echlin D.R. Gardner K. Taparowsky E. Vinson C. J. Biol. Chem. 1997; 272: 18586-18594 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (243) Google Scholar). يحتوي البلازميد pTRE - tk - CAT على تسلسلين إجماعيين TRE لمروج كيناز HSV thymidine (29Icard - Liepkalns C. Biguet n.f. Vyas S. Robert J. J. Sassone - Corsi P. Mallet J. J. Neurosci. Res. 1992; 32: 290-298 Crossref PubMed Scopus (105) Google Scholar). تم إنشاء ناقل pASCAT غير المتجانس، الذي تم فيه وضع نسخة من تسلسل -354 إلى -156 - bp من جين ALAS في المنبع من معزز ثيميدين كيناز، عن طريق استنساخ جزء AflII/StuI من PACAT في موقع SalI من pBLCAT2. وبالمثل، تم إنشاء ناقلات pAECATd أو pAECATi التي تحتوي على نسخة من -354 إلى -38 - bp من جين ALAS في الموضع الأيمن أو المقلوب، على التوالي، في المنبع من معزز ثيميدين كيناز عن طريق استنساخ جزء AflII/BstEII من PACAT في موقع SalI من pBLCAT2. تم توليد الطفرات عن طريق الطفرات الموجهة إلى الموقع القائمة على سلسلة البلمرة (Stratagene، La Jolla، CA). في ناقلات p -354 ALAS/CATM و pAECATdm و pAECATim، تحور موقع TRE - ALAS من النوع البري TGACGCA (خيط الترميز) إلى TGACGTG (خيط الترميز). تم التحقق من دقة جميع المتجهات الطافرة من خلال تسلسل الحمض النووي. كما تم استخدام البلازميد pCEFL الذي يحتوي على جين β - galactosidase. لإجراء فحوصات نقل العدوى، تم تنقية البلازميدات باستخدام WizardPlus Maxipreps (Promega Co). تم تقدير تركيز الحمض النووي بقياس الطيف الضوئي. نمت سلالة خلايا الورم الكبدي البشري HepG2 كمزارع أحادية الطبقة في الحد الأدنى من الوسط الأساسي المكمل بنسبة 10 ٪ (حجم/حجم) من مصل عجل الجنين المعطل بالحرارة و 1 ٪ من ستربتومايسين البنسلين، و 100 ميكرومتر من الأحماض الأمينية غير الضرورية، و 2 مم من الجلوتامين. تمت زراعة الخلايا في جو مرطب بنسبة 5 ٪ من ثاني أكسيد الكربون عند 37 درجة مئوية. لتحليل الحمض النووي الريبوزي، تمت إضافة الفينوباربيتال و TPA إلى خلايا HepG2 عند التقاء 75 ٪ في لوحات زراعة الأنسجة 100 مم للأوقات والتركيزات المفصلة في أساطير الشكل. تم إذابة الفينوباربيتال في 0.1 مل من الوسط المقابل. تم إذابة إسترات الفوربول والكالفوستين C في حجم صغير (أقل من 0.5 ٪ من إجمالي حجم وسائط الاستنبات) من Me2SO. تم عزل الحمض النووي الريبوزي الخلوي الكلي من خلايا HepG2 المستزرعة وفقًا لـ Chomczinsky و Sacchi (30Chomczinsky P. Sacchi N. Anal. Biochem. 1987; 71: 341-350 الباحث العلمي من Google). تم تقييم إنتاجية ونقاء عينات الحمض النووي الريبي من خلال نسبة الامتصاص عند 260 و 280 نانومتر. بالنسبة لتحليل البقعة الشمالية، تم تشويه 20 ميكروغرام من إجمالي الحمض النووي الريبوزي، وتم تشويهها بالكهرباء في 1 ٪ من هلام جليوكسال- أغاروز، ونقلها إلى أغشية النايلون (Hybond N،Amersham Biosciences). تم تهجين الأغشية بالتتابع مع مجسات تحمل علامة 32P للكبد البشري للأسف وبيتا توبولين. للكشف عن الحمض النووي الريبوزي المرسال للأسف، تم تصنيع أوليجوديوكسينوكليوتيد من 26 عامًا مكملًا للقواعد +328 إلى +353 من الحمض النووي الريبوزي المرسال البشري في كل مكان (31Bishop D.F. Nucleic Acids Res. 1990; 18: 7187-7188 Crossref PubMed Scopus (50) Google Scholar). تم تنقية الأوليجوديوكسينوكليوتيد وتم تصنيفه باستخدام [γ -32P]ATP و T4polynucleotide kinase. كان للمسبار الناتج نشاط محدد يبلغ حوالي 5–6 × 103 cpm/fmol. تم التهجين بين عشية وضحاها عند 70 درجة مئوية في نفس محلول التهجين المسبق بإضافة أوليجوديوكسينوكليوتيد 32P المسمى (3.0 × 105 cpm/cm2) كما هو موضح سابقًا (24Varone C.L. Giono L.E. Ochoa A. Zakin M.M. Cánepa E.T. Arch. Biochem. Biophys. 1999; 372: 261-270 Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar). للكشف عن β - tubulin mRNA، تم تصنيف الدجاج β - tubulin cDNA (هدية سخية من الدكتور J. ميسينا، فلوريدا) عن طريق التحضير العشوائي باستخدام [α -32P] dCTP و Klenow لنشاط محدد يبلغ حوالي 6 × 108 cpm/ميكروغرام. تم تجريد الأغشية وتهجينها مسبقًا وتهجينها وغسلها في الظروف القياسية التي وصفها Sambrook et al. (32Sambrook, J., and Russell, D. W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., pp. 7.42-7.45 and 17.48-17.51, Cold Spring Harbor Laboratory Press Cold Spring Harbor, NYGoogle Scholar). تم الحصول على الصور الإشعاعية الذاتية من خلال تعريض هذه البقع لفيلم كوداك XAR -5 مع شاشة مكثفة لمدة 3–5 أيام عند -70 درجة مئوية. تم إجراء عمليات نقل عابرة لـ HepG2 وفقًا لطريقة ترسيب فوسفات الكالسيوم القياسية كما هو موضح سابقًا (25Giono L.E. Varone C.L. Ca? nepa E.T. Biochem. J. 2001 ؛ 353: 307-316 Crossref PubMed Scopus (26) الباحث العلمي من Google). باختصار، تم نقل 4 ميكروغرام من PALAS/CAT أو مشتقاته و 6 ميكروغرام من pCEFLβgal إلى 5 × 105 خلايا مطلية على أطباق بتري 35 مم. تم استخدام بلازميد β - galactosidase كمعيار داخلي لتطبيع فعالية نقل العدوى. يشار إلى استخدام البلازميدات الأخرى المنقولة بالعدوى في كل تجربة. تم تحديد كمية متجهات التعبير Fos/Jun و CBP و p300 التي تم استخدامها في التجارب المختلفة مسبقًا من خلال منحنيات الجرعة والاستجابة. تم نقل كميات مختلفة من البلازميدات المذكورة بشكل مشترك إلى خلايا HepG2 جنبًا إلى جنب مع P -354ALAS/CAT، وتم قياس تعبير CAT. تم استخدام الحد الأدنى من كل بلازميد ينتج أقصى تأثير في التجارب اللاحقة. تم تعديل تركيز الحمض النووي النهائي إلى صحن 30 ميكروغرام/35 ملم مع حامل حمض نووي غير محدد. تم إجراء عمليات نقل السيطرة مع الناقل وحده والناقل بالإضافة إلى ناقل pBLCAT6 أو pBLCAT2 بالتوازي. بعد ستة عشر ساعة، تم استبدال الوسط بـ 3 مل من الوسط الخالي من المصل الذي يحتوي على الكواشف المشار إليها في كل تجربة وتم تحضينه لمدة 24 ساعة. ثم تم جمع الخلايا، وتم قياس نشاط القطط في مستخلصات الخلايا كما هو موضح سابقًا (25Giono L.E. Varone C.L. Cañnepa E.T. Biochem. J. 2001 ؛ 353: 307-316 Crossref PubMed Scopus (26) الباحث العلمي من Google) وفقًا لطريقة استخراج طور البذور واللمعان (33Seed B. Sheen JY Gene. 1988 ؛ 67: 271-277 Crossref PubMed Scopus (830) الباحث العلمي من Google). تم تحديد نشاط β - galactosidase بشكل طيفي في مستخلصات الخلايا المصابة (32Sambrook, J., and Russell, D. W. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed., pp. 7.42-7.45 and 17.48-17.51, Cold Spring Harbour Laboratory Press Cold Spring Harbor, NYGoogle Scholar). تم التعبير عن نشاط CAT على أنه كمية الكلورامفينيكول الموسومة بالإشعاع التي تم أسيتيلها بمقدار 1 ملغ من البروتين في دقيقة واحدة وتم تطبيعها مع نشاط β - galactosidase. لم يتم تعديل نشاط β - Galactosidase من خلال أي من العلاجات المستخدمة. تم تحديد تركيز البروتين لمستخلصات الخلية من خلال اختبار برادفورد (34 Bradford M. Anal. Biochem. 1976; 72: 248-254 Crossref PubMed Scopus (216391) Google Scholar). تم تحضير المستخلصات النووية من خلايا HepG2 المحفزة وغير المحفزة من TPA كما وصفها Andrews and Faller (35Andrews N.C. Faller D.V. Nucleic Acids Res. 1991; 19: 2499-2503 Crossref PubMed Scopus (2211) Google Scholar). كانت مسابير الحمض النووي مزدوجة السلسلة والمنافسين الباردين المستخدمين TRE - ALAS (موقع AP -1 يقع في -261 نقطة أساس)، 5′ - AGGAGTCTGACGCAGGGGT -3 ′، والمتحول، 5′ - AGGAGTCTGGGGGGGGGT -3 ′، المسمى TRE - ALASmut، حيث تم تحوير القواعد المسطرة لتعطيل الارتباط المحدد للبروتينات الرابطة لـ AP -1. كما تم استخدام أوليجوديوكسينوكليوتيد للتحكم الإيجابي يحتوي على موقع ربط AP -1 بالإجماع، 5 ′- CGCTTGATGAGTCAGCCGGGAA -3 ′، وأوليجوديوكسينوكليوتيد يحتوي على موقع CRE بالإجماع يتوافق مع -58 إلى -31 نقطة أساس من معزز جين سوماتوستاتين الفئران 5 ′- AGAGATTGCCTGACGTCAGAGCTAG -3 ′. كانت أوليجوديوكسينوكليوتيدات 5′- end - labeled with T4polynucleotide kinase and 222 TBq/mmol [γ -32P]dATP at 37 ° C for 60 min. تم إجراء تفاعلات الربط بخلط 10 ميكروغرام من المستخلص النووي مع 2 ميكروغرام من بولي(dI - dC) و 150،000 dpm من المجس المسمى في المخزن المؤقت TM (50 مم Tris - HCl، الرقم الهيدروجيني 7.9، 12.5 مم MgCl2، 1 مم EDTA، 1 مم dithiothreitol، 20 ٪ (v/v) glycerol) إلى حجم نهائي قدره 20 ميكرولتر وحضنت في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. عند ملاحظته، تم حضانة المستخلص النووي لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في خليط ربط مع الفائض المولي المشار إليه من الحمض النووي المنافس غير المسمى قبل إضافة المجس المسمى. بعد تفاعل الربط، تم إجراء الرحلان الكهربائي من خلال هلام بولي أكريلاميد غير مشبع بنسبة 5 ٪ يحتوي على 0.25× TBE (1× TBE: 50 mmTris borate، pH 8.3، 1 mm EDTA). ثم تم تجفيف الجل، وتم إجراء التصوير الإشعاعي الذاتي. تم إجراء تحليل التحول الفائق عن طريق حضانة المستخلص النووي باستخدام 3 ميكرولتر من جسم مضاد محدد عند 4 درجات مئوية لمدة 4 ساعات قبل مقايسات تحول النطاق الموصوفة بالفعل. تم شراء الأجسام المضادة ضد c - Fos و c - Jun و JunD من سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية (سانتا كروز، كاليفورنيا). تم طلاء خلايا HepG2 على أطباق 100 مم (2 × 106) ونقلها مع 2.5 ميكروغرام من ناقل تعبير CBP، حيث تم وسم CBP بـ HA، أو ناقل العمود الفقري باستخدام كاشف نقل العدوى Escort وفقًا لتوصيات الشركة المصنعة (Sigma). بعد يومين من انتقال العدوى، تم تحضير المحللات الكلية للخلايا في محلول اختبار ترسيب مناعي مشع (1× محلول ملحي مخزن للفوسفات، 1 ٪ Nonidet P -40، 0.5 ٪ ديوكسي كولات الصوديوم، 0.1 ٪ SDS، 10 ميكروغرام/مل من فلوريد فينيل ميثيل سلفونيل، 60 ميكروغرام/مل من بروتينين، و 1 مم من أورثوفانادات الصوديوم). تم طرد المحللات مركزيًا عند 10000 × جم لمدة 10 دقائق لإزالة بقايا الخلايا. تم ترسيب المحاليل التي تم تطهيرها (100 ميكروغرام) مناعيًا بجسم مضاد أحادي النسيلة (سانتا كروز). تم استعادة المجمعات المناعية على خرزات البروتين A/G - agarose (سانتا كروز) لمدة ساعة واحدة عند 4 درجات مئوية ثم تم غسلها 4 مرات بمحلول ملحي مخزن للفوسفات. تم إعادة تعليق البروتينات المترسبة في عينة عازلة تحتوي على 2 ٪ SDS و 30 مم بيتا ميركابتو إيثانول، مغلية لمدة 3 دقائق، مجزأة بواسطة SDS - PAGE على هلام 10 ٪، وبعد ذلك تم نقشها على غشاء نيتروسليلوز. تم بعد ذلك تلطيخ الغشاء مناعيًا بتقنية الإشارات الخلوية المضادة للأرانب متعددة النسيلة المضادة للفوسفور. تم الكشف عن الجسم المضاد باستخدام IgG (Sigma) للماعز المرتبط بالفجل الفجل المضاد للأرنب وتم تصويره بواسطة أنظمة إشارات Pierce Super Signal Ultra Chemiluminescence ومحلل التصوير الحيوي Fujifilm LAS -1000. بالنسبة للتقطيع المناعي المباشر لبروتينات الخلايا، تم تجزئة المحللات الخلوية الكلية للعينات المتوازية عن طريق الرحلان الكهربائي في SDS - PAGE على هلام 10 ٪، وتم نقل البروتينات إلى غشاء النيتروسليلوز. تم الكشف عن البروتين CREB باستخدام الجسم المضاد متعدد النسائل للأرنب المضاد لـ CREB (إشارات الخلية). تم تصور المجمعات المناعية عن طريق التلألؤ الكيميائي كما هو موضح أعلاه. درسنا أولاً تأثير TPA على التعبير عن جين للأسف في خلايا HepG2 إما في الظروف القاعدية أو المستحثة. تم حضانة هذه الخلايا باستخدام 1 ميكرومتر من TPA لمدة تصل إلى 24 ساعة في وجود أو عدم وجود الفينوباربيتال 0.6 مم، وهو محفز معروف للتعبير الجيني للأسف (36Schuurmans M.M. Hoffmann F. Lindberg R.L. Meyer U.A. Hepatology. 2001 ؛ 33: 1217-1222 Crossref PubMed Scopus (21) الباحث العلمي من Google). أظهر تحليل البقعة الشمالية أنه في كلتا الحالتين كان هناك انخفاض يعتمد على الوقت في مستويات الحمض النووي الريبوزي المرسال للأسف، مما يشير إلى أن TPA يثبط التعبير الجيني للأسف في خلايا HepG2 (الشكل 1 أ). كشفت علاقة تركيز واستجابة TPA لتثبيط الحمض النووي الريبوزي المرسال للأسف عن تأثير يعتمد على الجرعة. كان TPA فعالًا على نطاق تركيز من 10−8 إلى 10−5 م، وتم الوصول إلى الحد الأقصى للتثبيط عند 10−6 م وأكثر (الشكل 1 ب). تتفق هذه النتائج مع الملاحظات السابقة التي تم إجراؤها في المزارع الأولية للخلايا الكبدية للجرذان (23Varone C.L. Cañnepa E.T. Arch. Biochem. Biophys. 1997; 341: 259-266 Crossref PubMed Scopus (11) Google Scholar). لتحديد ما إذا كانت التسلسلات في المنطقة المحيطة بـ 5بوصات من جين للأسف يمكن أن تمنح استجابة TPA، قمنا بدمج حوالي 870 نقطة أساس من هذه المنطقة في جين المراسل البكتيري لـ CAT. تم نقل خلايا HepG2 بشكل عابر باستخدام ناقلات الأسف/القطط هذه ثم تحضينها بكميات مختلفة من TPA قبل حصاد وتحليل نشاط القطط (الشكل 1 C). تسبب TPA في تثبيط يعتمد على الجرعة في التعبير عن الأسف/القط مع انخفاض بحد أقصى 5 أضعاف تقريبًا في الخلايا غير المعالجة و 8 أضعاف في الخلايا المعرضة للفينوباربيتال 0.6 مم. تم اختبار عمل 4 αPDA، وهو نظير TPA غير فعال في تعزيز الورم وتنشيط PKC، لاستبعاد إمكانية حدوث تأثير مثبط عام بسبب الحضانة مع إسترات الفوربول. فشلت إضافة 1 ميكرومتر 4 αPDA في تقليل التعبير عن الأسف/القط (البيانات غير معروضة). في العديد من أنواع الخلايا، أدى العلاج المطول باسترات الفوربول إلى استنفاد كامل تقريبًا لـ PKC الخلوي. نظرًا لأن تنشيط PKC أدى إلى تثبيط التعبير الجيني للأسف، فقد تمت معالجة خلايا HepG2 المنقولة مؤقتًا بـ ALAS/CAT باستخدام 1 ميكرومتر من TPA لمدة 12 ساعة لتحديد ما إذا كان انخفاض PKC عن طريق النقل إلى غشاء الخلية قد منع هذا التثبيط. لاحظنا أن تحفيز PKC المطول أدى إلى انسداد تثبيط للأسف بواسطة TPA في كل من الحالات المحفزة القاعدية والفينوباربيتال (البيانات غير موضحة). علاوة على ذلك، أدى حضانة خلايا HepG2 المنقولة بواسطة ALAS/CAT مع 1 ميكرومتر كالفوستين C، وهو مثبط PKC، إلى انسداد التأثير المثبط لـ 1 ميكرومتر TPA على نشاط معزز ALAS (الشكل 2). تشير هذه النتائج إلى أن PKC متورط في التأثير المثبط للتعبير الجيني للأسف. لتحديد عناصر الاستجابة التي تعمل على الكيس في المنطقة المحيطة بـ 5'من جين الفئران التي تستجيب لـ TPA، تم إنشاء سلسلة من طفرات الحذف الأطول تدريجيًا لـ ALAS/CAT. كما هو الحال في ALAS/CAT، تم نقل هذه الطفرات المعززة للحذف بشكل عابر إلى خلايا HepG2 وفحصها لنشاط CAT في غياب ووجود 1 ميكرومتر TPA. كما هو موضح في الشكل 3، فإن الحذف التدريجي للتسلسلات من -833 إلى -354 نقطة أساس لم يضعف بشكل كبير من تثبيط نشاط المحفز بوساطة TPA