Les spermatozoïdes de mammifères acquièrent une capacité de fertilisation dans le tractus féminin au cours d'un processus connu sous le nom de capacitation. Dans le sperme de souris, ce processus est associé à une augmentation de la phosphorylation de la tyrosine protéique, à une hyperpolarisation potentielle de la membrane, à une augmentation du pH intracellulaire et du Ca2+ et à une motilité hyperactivée. Les mécanismes moléculaires impliqués dans ces changements ne sont pas entièrement connus. Les preuves actuelles suggèrent que dans le sperme de souris, l'hyperpolarisation membranaire associée à la capacitation est régulée par une voie dépendante de l'AMPc/protéine kinase A impliquant l'activation des canaux K+ à rectification interne et l'inhibition des canaux sodiques épithéliaux (ENaC). Le régulateur de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose (CFTR) est un canal Cl- qui contrôle l'activité de plusieurs protéines de transport, y compris les ENaC. Ici, nous avons exploré si CFTR est impliqué dans la régulation de l'inhibition de l'ENaC dans le sperme et est donc essentiel pour l'hyperpolarisation associée à la capacitation. En utilisant la transcription inverse-PCR, le Western blot et l'immunocytochimie, nous documentons la présence de CFTR dans le sperme de souris et d'humains. Fait intéressant, l'ajout d'un inhibiteur du CFTR (acide diphénylamine-2-carboxylique ; 250 μm) a inhibé l'hyperpolarisation associée à la capacitation, empêché la fermeture de l'ENaC et diminué la réaction acrosomique induite par la zone pellucide sans affecter l'augmentation de la phosphorylation de la tyrosine. L'incubation des spermatozoïdes dans un milieu sans Cl a également éliminé l'hyperpolarisation associée à la capacitation. D'autre part, un activateur CFTR (génistéine ; 5-10 μm) a favorisé l'hyperpolarisation dans le sperme de souris incubé dans des conditions qui ne supportent pas la capacitation. L'ajout d'AMP cyclique dibutyryle à du sperme de souris non capacité a élevé le Cl- intracellulaire. Ces résultats suggèrent que les flux de Cl- dépendants de l'AMPc à travers le CFTR sont impliqués dans la régulation de l'ENaC pendant la capacitation et contribuent ainsi à l'hyperpolarisation observée associée à ce processus. Les spermatozoïdes de mammifères acquièrent une capacité de fertilisation dans le tractus féminin au cours d'un processus connu sous le nom de capacitation. Dans le sperme de souris, ce processus est associé à une augmentation de la phosphorylation de la tyrosine protéique, à une hyperpolarisation potentielle de la membrane, à une augmentation du pH intracellulaire et du Ca2+ et à une motilité hyperactivée. Les mécanismes moléculaires impliqués dans ces changements ne sont pas entièrement connus. Les preuves actuelles suggèrent que dans le sperme de souris, l'hyperpolarisation membranaire associée à la capacitation est régulée par une voie dépendante de l'AMPc/protéine kinase A impliquant l'activation des canaux K+ à rectification interne et l'inhibition des canaux sodiques épithéliaux (ENaC). Le régulateur de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose (CFTR) est un canal Cl- qui contrôle l'activité de plusieurs protéines de transport, y compris les ENaC. Ici, nous avons exploré si CFTR est impliqué dans la régulation de l'inhibition de l'ENaC dans le sperme et est donc essentiel pour l'hyperpolarisation associée à la capacitation. En utilisant la transcription inverse-PCR, le Western blot et l'immunocytochimie, nous documentons la présence de CFTR dans le sperme de souris et d'humains. Fait intéressant, l'ajout d'un inhibiteur du CFTR (acide diphénylamine-2-carboxylique ; 250 μm) a inhibé l'hyperpolarisation associée à la capacitation, empêché la fermeture de l'ENaC et diminué la réaction acrosomique induite par la zone pellucide sans affecter l'augmentation de la phosphorylation de la tyrosine. L'incubation des spermatozoïdes dans un milieu sans Cl a également éliminé l'hyperpolarisation associée à la capacitation. D'autre part, un activateur CFTR (génistéine ; 5-10 μm) a favorisé l'hyperpolarisation dans le sperme de souris incubé dans des conditions qui ne supportent pas la capacitation. L'ajout d'AMP cyclique dibutyryle à du sperme de souris non capacité a élevé le Cl- intracellulaire. Ces résultats suggèrent que les flux de Cl- dépendants de l'AMPc à travers le CFTR sont impliqués dans la régulation de l'ENaC pendant la capacitation et contribuent ainsi à l'hyperpolarisation observée associée à ce processus. La capacitation des spermatozoïdes est un phénomène complexe nécessaire à la fertilisation. Dans le sperme de souris, la capacitation comprend la réorganisation de la membrane plasmique, l'augmentation de la phosphorylation de la tyrosine protéique, l'hyperpolarisation du potentiel de membrane plasmique (Em), 2Les abréviations utilisées sont : Em, potentiel de membrane plasmique ; AR, réaction acrosomique ; ZP, zona pellucida ; ENaC, canal sodique épithélial ; PKA, protéine kinase A ; CFTR, régulateur de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose ; Bt2cAMP, AMP cyclique dibutyrylique ; IBMX, acide 3-isobutyl-1-méthylxantine ; MQAE, bromure de N-(éthoxycarbonylméthyl) -6-méthoxyquinolinium ; DiSC3 (5), iodure de 3,3′ -dipropylthiadicarbocyanine ; SITS, 4-acétomido-4 ′ -isothiocyanatostilbène-2,2′-disulfonique ; TRITC, isothiocyanate de tétraméthylrhodamine ; DPC, acide diphénylamine-2-carboxylique ; WH, Whitten' s HEPES-buffered et augmente le pH intraculaire (pHi) et (Ca2+ [Ca2+]i) (examinés dans Refs. 1Darszon A. Nishigaki T. Wood C. Trevino C.L. Felix R. Beltran C. Int. Cytol. 2005 ; 243: 79-172Crossref PubMed Scopus (139) Google Scholar et 2Visconti p.e. Westbrook V.A. Chertihin O. Demarco I. Sleight S. Diekman A.B. J. Reprod. Immunol. 2002 ; 53: 133-150Crossref PubMed Scopus (290) Google Scholar). La capacitation est également associée à l'apparition d'une motilité hyperactivée (3Yanagimachi R. Knobile E. Neill J.D. The Physiology of Reproduction. 1. 1994: 189-317Google Scholar). Tous ces changements amènent les spermatozoïdes à atteindre et à pénétrer efficacement les couches externes de l'œuf et à subir la réaction acrosomique (RA) (4Florman H.M. Arnoult C. Kazam I.G. Li C. O'Toole C.M. Biol. Reprod. 1998 ; 59: 12-16Crossref PubMed Scopus (166) Google Scholar). Parmi les changements observés au cours de la capacitation du sperme de souris, l'hyperpolarisation qui a lieu au cours de ce processus a été proposée pour jouer le rôle important d'éliminer l'inactivation des canaux Ca2+ dépendants de la tension de sorte qu'ils s'ouvrent sur une dépolarisation induite par la zone pellucide (ZP) et déclenchent l'AR. On sait peu de choses sur les entités moléculaires qui participent à cette hyperpolarisation et sur la façon dont tous les changements associés à la capacitation sont combinés pour promouvoir la capacitation. Plusieurs candidats ont été proposés pour participer à l'hyperpolarisation induite par la capacitation. Des études de notre groupe ont démontré que les canaux K+ à rectification interne contribuent à cette hyperpolarisation (5Munoz-Garay C. De la Vega-Beltran J.L. Delgado R. Labarca P. Felix R. Darszon A. Dev. Biol. 2001 ; 234: 261-274Crossref PubMed Scopus (83) Google Scholar, 6Acevedo J.J. Mendoza-Lujambio I. de la Vega-Beltran J.L. Trevino C.L. Felix R. Darszon A. Dev. Biol. 2006 ; 289: 395-405Crossref PubMed Scopus (45) Google Scholar). En outre, nous avons documenté qu'un cotransporteur électrogène Na+/HCO3− hyperpolarise le sperme de souris lorsque le HCO3− externe est élevé (7Demarco I.A. Espinosa F. Edwards J. Sosnik J. De La Vega-Beltran J.L. Hockensmith J.W. Kopf G.S. Darszon A. Visconti P.E. J. Biol. Chem. 2003 ; 278: 7001-7009Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (176) Google Scholar). En outre, nous avons récemment signalé la présence de canaux Na+ épithéliaux (ENaC) dans le sperme de souris et montré qu'une réduction de la perméabilité Na+ du sperme est essentielle pour l'hyperpolarisation associée à la capacitation (8Hernandez-Gonzalez E.O. Sosnik J. Edwards J. Acevedo J.J. Mendoza-Lujambio I. Lopez-Gonzalez I. Demarco I. Wertheimer E. Darszon A. Visconti P.E. J. Biol. Chem. 2006 ; 281: 5623-5633Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (102) Google Scholar). Ce travail ultérieur suggère fortement que les spermatozoïdes de souris (ENaC) sont constitutivement actifs dans les spermatozoïdes non capacités et se ferment pendant la capacitation, entraînant une hyperpolarisation Em. Fait intéressant, les expériences de ce travail suggèrent que la fermeture des ENaC est régulée directement ou indirectement par une voie dépendante de l'AMPc/protéine kinase A (PKA) (8Hernandez-Gonzalez E.O. Sosnik J. Edwards J. Acevedo J.J. Mendoza-Lujambio I. Lopez-Gonzalez I. Demarco I. Wertheimer E. Darszon A. Visconti P.E. J. Biol. Chem. 2006 ; 281: 5623-5633Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (102) Google Scholar). Le régulateur de la conductance transmembranaire de la mucoviscidose (CFTR) est un canal Cl- modulé par l'AMPc et un régulateur de plusieurs transporteurs et protéines, y compris les canaux K+, tels que ROMK1 et ROMK2 (9Kunzelmann K. Schreiber R. J. Membr. Biol. 1999 ; 168: 1-8Crossref PubMed Scopus (95) Google Scholar, 10Liu X. Singh B.B. Ambudkar I.S. J. Biol. Chem. 1999 ; 274: 25121-25129Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (29) Google Scholar), anion exchangeers, aquaporins, and ENaCs (11Briel M. Greger R. Kunzelmann K. J. Physiol. (Lond.). 1998 ; 508: 825-836Crossref Scopus (115) Google Scholar). Dans les canaux sudoripares absorbant le sel, l'activation du CFTR provoque une stimulation de l'ENaC (12Nagel G. Szellas T. Riordan J.R. Friedrich T. Hartung K. EMBO Rep. 2001 ; 2: 249-254Crossref PubMed Scopus (51) Google Scholar). Dans d'autres tissus absorbants ou sécrétoires, selon le besoin physiologique, l'activation du CFTR inhibe réciproquement les ENaC (13Schwiebert E.M. Benos D.J. Egan M.E. Stutts M.J. Guggino W.B. Physiol. Rev. 1999 ; 79: 145-166Crossref PubMed Scopus (379) Google Scholar). La mucoviscidose, la maladie génétique humaine la plus répandue, est causée par des mutations CFTR (14Guggino W.B. Stanton B.A. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2006 ; 7: 426-436Crossref PubMed Scopus (350) Google Scholar). De plus, l'implication du CFTR dans l'infertilité masculine et féminine est reconnue depuis longtemps (15Jarzabek K. Zbucka M. Pepinski W. Szamatowicz J. Domitrz J. Janica J. Wolczynski S. Szamatowicz M. Reprod. Biol. 2004 ; 4: 119-129PubMed Google Scholar). Presque tous les hommes atteints de mucoviscidose sont stériles en raison d'une absence bilatérale congénitale de déférence vasculaire. Récemment, Chan et al. (16Chan H.C. Shi Q.X. Zhou C.X. Wang X.F. Xu W.M. Chen W.Y. Chen A.J. Ni Y. Yuan Y.Y. Mol. Cell. Endocrinol. 2006 ; 250: 106-113Crossref PubMed Scopus (62) Google Scholar) a proposé que la perméation de HCO3− à travers CFTR (17Poulsen J.H. Fischer H. Illek B. Machen T.E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994 ; 91: 5340-5344Crossref PubMed Scopus (365) Google Scholar) présent dans les cellules de l'endomètre joue un rôle lors de la capacitation in vivo des spermatozoïdes et peut expliquer certains cas d'infertilité de la mucoviscidose féminine. Cette constatation est conforme à l'exigence de HCO3− pour la capacitation. Plusieurs modes de régulation du CFTR ont été explorés, notamment la phosphorylation, les niveaux de Cl et d'ATP, Em et l'interaction directe protéine-protéine (12Nagel G. Szellas T. Riordan J.R. Friedrich T. Hartung K. EMBO Rep. 2001 ; 2: 249-254Crossref PubMed Scopus (51) Google Scholar, 18Kunzelmann K. Kiser G.L. Schreiber R. Riordan J.R. FEBS Lett. 1997 ; 400: 341-344Crossref PubMed Scopus (130) Google Scholar, 19Reddy M.M. Quinton P.M. Am. J. Physiol. 2006 ; 291 (-C129) : C122Crossref Scopus (15) Google Scholar). Fait intéressant, le CFTR et l'ENaC se colocalisent et peuvent interagir dans plusieurs tissus (14Guggino W.B. Stanton B.A. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2006 ; 7: 426-436Crossref PubMed Scopus (350) Google Scholar). Dans ce travail, nous documentons la présence de CFTR dans les spermatozoïdes de souris et d'humains et démontrons que l'acide diphénylamine-2-carboxylique (DPC), un inhibiteur de CFTR, bloque l'hyperpolarisation associée à la capacitation. De plus, la génistéine, un activateur des canaux CFTR, a hyperpolarisé les spermatozoïdes dans des conditions qui ne supportent pas la capacitation. Ces changements induits par la génistéine dans l'Em ont été inhibés par la DPC. Étant donné que CFTR est un canal Cl-, nous avons utilisé la sonde fluorescente Cl- bromure de N-(éthoxycarbonylméthyl) -6-méthoxyquinolinium (MQAE) pour déterminer la concentration intracellulaire de Cl- ([Cl-]i) du sperme de souris non capacité et avons exploré l'influence des régulateurs CFTR sur ce paramètre. L'ajout de génistéine, ainsi que d'analogues de l'AMPc, a favorisé l'afflux de Cl- dans les spermatozoïdes non condensés bloqués par la DPC. Considérant que la fermeture des ENaC dans les spermatozoïdes est régulée par une voie d'AMPc, nous avons émis l'hypothèse que la régulation CFTR de l'Em des spermatozoïdes pourrait être médiée par les ENaC. Conformément à cette hypothèse, la génistéine a diminué l'hyperpolarisation induite par les amilorides et la perméabilité au Na+ sensible aux amilorides dans les spermatozoïdes non condensés que nous avions rapportés plus tôt (8Hernandez-Gonzalez E.O. Sosnik J. Edwards J. Acevedo J.J. Mendoza-Lujambio I. Lopez-Gonzalez I. Demarco I. Wertheimer E. Darszon A. Visconti P.E. J. Biol. Chem. 2006 ; 281: 5623-5633Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (102) Google Scholar), suggérant que CFTR régule l'hyperpolarisation associée à la capacitation dans le sperme de souris par l'inhibition des ENaC. Matériaux - L'amiloride, l'AMP cyclique dibutyrylique (Bt2cAMP), la 3-isobutyl-1-méthylxantine (IBMX), le cyanure de carbonyle, la m-chlorophénylhydrazone, la valinomycine, la nigéricine, le gluconate de sodium et le gluconate de potassium ont été achetés auprès de Sigma. Le MQAE, l'iodure de 3,3′ -dipropylthiadicarbocyanine (DiSC3 (5)), l'acide4-acétomido-4 ′-isothiocyanatostilbène-2,2′-disulfonique (SITS) ont été obtenus à partir d'Invitrogen. L'anticorps polyclonal contre le CFTR a été acheté auprès de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Les souris anti-IgG de chèvre conjuguées à la biotine et à l'Avidine conjuguées au TRITC provenaient de Pierce. Le DPC provenait de Sigma. Le DPC (stock de 10 mm), la génistéine, leDiSC3 (5), le cyanure de carbonyle m-chlorophénylhydrazone et la valinomycine (stocks de 1 mm) ont été préparés dans du Me2SO et stockés à -20 °C jusqu'à leur utilisation. Bt2cAMP (1 mm), H-89 et IBMX (100 μm) ont été préparés le jour de l'expérience en utilisant un milieu Krebs-Ringer modifié (milieu Whitten' s HEPES-buffered (WH)) (20Moore G.D. Ayabe T. Visconti P.E. Schultz R.M. Kopf G.S. Development. 1994 ; 120: 3313-3323Crossref PubMed Google Scholar) et utilisé à la concentration indiquée. Préparation des spermatozoïdes - Les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le comité local de soins aux animaux et de bioéthique de l'Instituto de Biotecnologiía-Universidad Nacional Autónoma de México. Dans la plupart des expériences, le sperme de souris épididymaire caudale a été recueilli auprès d'éleveurs mâles retraités CD1 en plaçant l'épididyme caudal haché dans le milieu WH. Ce milieu ne prend pas en charge la capacitation à moins d'être supplémenté avec 5 mg/ml d'albumine sérique bovine et 24 mm de NaHCO3. Après 10 min, la suspension de sperme a été lavée dans 10 ml du même milieu par centrifugation à 800 x g pendant 10 min à température ambiante. Les spermatozoïdes ont ensuite été remis en suspension à une concentration finale de 2 × 107 cellules/ml et dilués 10 fois dans le milieu approprié en fonction de l'expérience. Pour étudier le rôle de Cl- dans la capacitation et dans la régulation de Em, NaCl et KCl ont été remplacés par le gluconate de sodium et le gluconate de potassium, respectivement. Préparation des spermatozoïdes humains - Les spermatozoïdes ont été obtenus de volontaires normaux et fertiles par masturbation après au moins 2 jours d'abstinence. Après liquéfaction, 1 ml de Ham' s F-10 a été appliqué sur 1 ml de sperme pour permettre aux spermatozoïdes mobiles de remonter dans la couche supérieure de la suspension (1 h à 37 °C). Des spermatozoïdes de natation ont été collectés et ajustés à 1 × 106 cellules/ml. Des échantillons ont été utilisés pour l'analyse par Western blot et l'analyse par immunofluorescence indirecte comme décrit pour le sperme de souris. Expériences d'isolement d'ARN et de transcription inverse-PCR - L'ARN total a été préparé à partir de spermatides allongées de souris isolées (21 Bellve A.R. Methods Enzymol. 1993 ; 225: 84-113Crossref PubMed Scopus (300) Google Scholar) ou sperme humain éjaculé, en utilisant le réactif TRIzol (Sigma) selon les instructions du fabricant. L'ADNc a été synthétisé à partir d'échantillons d'ARN total avec une transcription inverse à amorçage hexamère aléatoire (transcriptase inverse RNase H Superscript II ; Invitrogen). L'ADNc a ensuite été soumis à une amplification PCR en utilisant la TaqDNA polymérase (Invitrogen). Les amorces de sous-unité CFTR ont été conçues en utilisant la séquence nucléotidique rapportée chez l'homme et la souris pour ces gènes (CFTR NM_020038 humain et CFTR NM_021050 murin, respectivement). Les séquences d'amorces pour le CFTR humain sont les suivantes : avant, 5′-ATG ATT ATG GGA GAA CTG G-3 ; arrière, 5′-ATG AGA AAC GGT GTA AGG T-3′. Les séquences d'amorces pour le CFTR de souris sont les suivantes : avant, 5′-GGA GCA AAC CCA AAC A-3′ ; arrière, 5′-AGC AGC CAC CAC CTC AAC C-3′. L'absence de contamination génomique dans les échantillons d'ARN a été confirmée par des contrôles négatifs à la transcription inverse (pas de transcription inverse) pour chaque expérience. Les produits amplifiés ont été analysés par séquençage d'ADN afin de confirmer leur identité. SDS-PAGE et Immunoblotting - Des extraits de spermatozoïdes humains et de souris ont été obtenus par la méthode décrite par Ref. 22Hernandez-Gonzalez E.O. Lecona-Valera A.N. Escobar-Herrera J. Mujica A. Cell Motil. Cytoskeleton. 2000 ; 46: 43-58Crossref PubMed Scopus (46) Google Scholar. Les spermatozoïdes ont été remis en suspension dans un tampon d'échantillon contenant des inhibiteurs de protéase sans 2-mercaptoéthanol, et bouillis pendant 5 min. Les échantillons de sperme ont été centrifugés à 10 000 × g pendant 15 min. Après centrifugation, les surnageants ont été recueillis et le 2-mercaptoéthanol a été ajouté à une concentration finale de 5% (v/v). Les échantillons ont été bouillis pendant 5 min supplémentaires, puis soumis à 10 % de SDS-PAGE (23Laemmli U.K. Nature. 1970 ; 227: 680-685Crossref PubMed Scopus (207537) Google Scholar). L'électrotransfert de protéines vers Immobilon P (Bio-Rad) et l'immunodétection de CFTR ont été réalisés comme décrit précédemment (24Kalab P. Visconti P. Leclerc P. Kopf G.S. J. Biol. Chem. 1994 ; 269: 3810-3817Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Les immunoblots ont été incubés avec un anti-CFTR et développés avec l'anticorps secondaire approprié conjugué à la peroxydase de raifort (Sigma) et au kit chimioluminescent ECL (Amersham Biosciences) selon les instructions du fabricant. Immunofluorescence indirecte - Des suspensions de sperme ont été fixées dans du paraformaldéhyde (concentration finale de 4%) pendant 30 min à température ambiante, lavées par centrifugation à 800 × g pendant 5 min, perméabilisées dans du PBS-Triton X-100 (concentration finale de 0,05%) pendant 15 min à température ambiante et lavées trois fois avec du PBS. Des anticorps primaires spécifiques ont été ajoutés à des échantillons de sperme et incubés pendant une nuit à 4 °C, lavés trois fois avec du PBS, puis incubés avec l'anticorps secondaire approprié (IgG anti-rabbit conjuguée à la biotine) pendant 1 h à 37 °C. L'anticorps secondaire a ensuite été soumis à trois lavages consécutifs avec du PBS et développé par incubation avec de l'isothiocyanate d'avidine-fluorescéine dilué dans du tampon HEPES-salé (20 mm HEPES et 100 mm NaCl, pH 8,2) pendant 1h à 37 °C. Enfin, les échantillons ont été lavés et montés dans du PBS-glycérol (SlowFade, Molecular Probes) et examinés au microscope confocal. Dosage du potentiel membranaire dans les populations de spermatozoïdes - Em a été mesuré comme décrit précédemment (7Demarco I.A. Espinosa F. Edwards J. Sosnik J. De La Vega-Beltran J.L. Hockensmith J.W. Kopf G.S. Darszon A. Visconti P.E. J. Biol. Chem. 2003 ; 278: 7001-7009Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (176) Google Scholar). Brièvement, les spermatozoïdes ont été collectés comme indiqué ci-dessus, dilués dans le milieu approprié et capacités pendant différentes périodes en fonction de l'expérience. Huit minutes avant la mesure, 1 μm DiSC3(5) (concentration finale) a été ajouté à la suspension de sperme et incubé pendant 5 minutes à 37 °C. Un μm de m-chlorophénylhydrazone de cyanure de carbonyle (concentration finale) a ensuite été ajouté pour réduire le potentiel mitochondrial, et les spermatozoïdes ont été incubés pendant 2 min supplémentaires. Après cette période, 1,5 ml de la suspension a été transféré dans une cuvette doucement agitée à 37 °C, et la fluorescence (excitation/émission 620/670 nm) a été enregistrée en continu. L'étalonnage a été effectué comme décrit précédemment en ajoutant de la valinomycine 1 μm et des ajouts séquentiels de KCl. Dépolarisation induite par Na+ et hyperpolarisation induite par Amiloride - Après avoir atteint la fluorescence à l'état d'équilibre, 50 mm de NaCl ont été ajoutés tandis que la fluorescence a été enregistrée en présence ou en l'absence de différents composés comme indiqué dans chaque figure. Après avoir atteint un nouvel état d'équilibre fluorescent, l'étalonnage a été effectué comme indiqué ci-dessus. Les changements Em provoqués par le NaCl ont été quantifiés, en tenant compte de la courbe d'étalonnage et de la fluorescence initiale à l'état d'équilibre avant l'addition de NaCl. Les contrôles visant à déterminer si l'amiloride ou son solvant (Me2SO) modifiaient la fluorescence de DiSC3(5) ont été effectués uniquement avec un colorant et n'ont pas montré de changements significatifs de fluorescence (données non présentées). Les mesures intracellulaires de Cl- dans les populations de spermatozoïdes- [Cl-]i ont été mesurées dans les populations de spermatozoïdes à l'aide d'un colorant fluorescent sensible au Cl (MQAE) (25Verkman A.S. Sellers M.C. Chao A.C. Leung T. Ketcham R. Anal. Biochem. 1989 ; 178: 355-361Crossref PubMed Scopus (179) Google Scholar). Les spermatozoïdes ont été incubés avec 10 mm MQAE pendant 30 min à 37 °C. L'excès de MQAE a été éliminé en diluant les spermatozoïdes 10 fois avec du milieu sans WH-Cl (gluconate de sodium de 100 mm, gluconate de potassium de 4,4 mm, KH2PO4 de 1,2 mm, MgSO4 de 1,2 mm, glucose de 5,4 mm, acide pyruvique de 0,8 mm, acide lactique de 4,8 mm, HEPES de 20 mm, pH 7,2) et en centrifugeant pendant 3 min à 300 × g. Le culot de sperme a été remis en suspension dans des aliquotes de 2 × 106 spermatozoïdes/ml avec du milieu dans les conditions suivantes. 1) Pour obtenir la fluorescence maximale (Fmax), un milieu sans WH-Cl- avec de la nigéricine (10 μm) et du tributylétain (10 μm) a été utilisé. 2) Pour déterminer la fluorescence à des concentrations définies de Cl- (FCl-), deux milieux ont été mélangés (WH contenant différentes concentrations de NaCl (10-100 mm) et les milieux sans WH-Cl- gardant Cl- + gluconate- = 100 mm) ; la nigéricine (10 μm) et le tributylétain (10 μm) ont également été ajoutés. 3) Pour une fluorescence minimale (Fmin), du KSCN de 150 mm tamponné avec de l'HEPES de 10 mm (pH 7,2) et de la valinomycine de 5 μm a été utilisé. Les échantillons ont été éclairés à 350 nm et l'émission a été collectée à 450 nm. La relation entre la concentration en Cl- et l'intensité de fluorescence MQAE exprimée par le rapport F0/FCl- fournit une ligne droite avec une pente égale à Kq, la constante de Stern-Volmer, où le signal total pouvant être éteint F0 est défini par Fmax - Fmin. [Cl-]i a été estimé en utilisant la parcelle construite (25VERKMAN A.S. Sellers M.C. Chao A.C. Leung T. Ketcham R. Anal. Biochem. 1989 ; 178: 355-361Crossref PubMed Scopus (179) Google Scholar, 26Inglefield J.R. Schwartz-Bloom R.D. Methods. 1999 ; 18: 197-203Crossref PubMed Scopus (28) Google Scholar, 27Jayaraman S. Biwersi J. Verkman A.S. Am. J. Physiol. 1999 ; 276 (-C757) : C747Crossref PubMed Google Scholar). Le sperme [Cl-]i a également été évalué selon Garcia et Meizel (28Garcia M.A. Meizel S. J. Androl. 1999 ; 20: 88-93PubMed Google Scholar). Les spermatozoïdes de souris ont été incubés pendant 30 min dans un milieu WH contenant différentes concentrations de Cl- (0-100 mm) et 10 mm MQAE. L'excès de MQAE a été éliminé comme mentionné ci-dessus, et les données d'intensité de fluorescence d'émission des suspensions de spermatozoïdes (2 × 106 sperm/ml) ont été enregistrées pendant 120 s. Le [Cl-] intracellulaire et extracellulaire ont été équilibrés en perméabilisant la membrane du sperme avec de la digitonine (10 μm), et la fluorescence a été enregistrée pendant encore 120 s. Le [Cl-]i a été calculé comme décrit par Garcia et Meizel (28Garcia M.A. Meizel S. J. Androl. 1999 ; 20: 88-93PubMed Google Scholar). Il est important de noter que les valeurs de la [Cl-]i doivent être prises avec prudence, car elles sont obtenues à partir d'une population de spermatozoïdes hétérogène. Les déterminations de Cl nécessitent un étalonnage, qui suppose que le colorant se comporte dans les spermatozoïdes comme dans les autres cellules (24Kalab P. Visconti P. Leclerc P. Kopf G.S. J. Biol. Chem. 1994 ; 269: 3810-3817Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 25Verkman A.S. Sellers M.C. Chao A.C. Leung T. Ketcham R. Anal. Biochem. 1989 ; 178: 355-361Crossref PubMed Scopus (179) Google Scholar, 26Inglefield J.R. Schwartz-Bloom R.D. Methods. 1999 ; 18: 197-203Crossref PubMed Scopus (28) Google Scholar) et ne corrige pas le colorant externe résiduel et certaines différences dans les conditions expérimentales. Il n'est possible de laver les spermatozoïdes de souris qu'une seule fois par centrifugation, car ils perdent leur viabilité s'ils sont centrifugés davantage. L'influence de différents médicaments (c.-à-d. génistéine, AMPc/IBMX, DPC, H-89 et SITS) SUR [Cl-]i a été déterminée à l'aide de suspensions de spermatozoïdes chargées de MQAE comme décrit ci-dessus, après avoir enregistré la fluorescence basale pendant 1 à 3 min et mesuré pendant 5 à 10 min supplémentaires. Deux contrôles ont été effectués : 1) des solvants médicamenteux (Me2SO ou eau) ont été ajoutés pendant que la fluorescence était enregistrée, et 2) la fluorescence MQAE sans cellules a été enregistrée, et les médicaments ont été ajoutés. Aucune modification significative de la fluorescence n'a été observée après la réalisation des deux contrôles (données non présentées). Les changements [Cl-]i ont été estimés comme décrit ci-dessus. Acrosome Reaction Assay—Caudal epididymal mouse sperm were collected from CD1 mice and placed in capped 1.5-ml microcentrifuge tubes containing medium 199 (Sigma) supplemented with bovine serum albumin (0.4%, w/v), Na+ pyruvate (30 mg/litre), and NaHCO3 (2.2 g/litre) at 37 °C (4-5 × 106 cells/ml). La méthode Swim-up (29Henkel R.R. Schill W.B. Reprod. Biol. Endocrinol. 2003 ; 1: 108Crossref PubMed Scopus (380) Google Scholar) a été utilisé pour séparer les spermatozoïdes avec une motilité >90%. La suspension de sperme a été incubée 10 min, et la partie supérieure ∼1 ml a été séparée et capacitée pendant 30 min à 37 °C (30Visconti P.E. Galantino-Homer H. Ning X. Moore G.D. Valenzuela J.P. Jorgez C.J. Alvarez J.G. Kopf G.S. J. Biol. Chem. 1999 ; 274: 3235-3242Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (271) Google Scholar). La RA a été induite après capacitation (en présence ou en l'absence de DPC) dans une aliquote de 30 μl en ajoutant 5 ZP eq/μl ou 15 μm A23187. La ZP a été obtenue à partir d'ovocytes de souris (31Cross N.L. Meizel S. Biol. Reprod. 1989 ; 41: 635-641Crossref PubMed Scopus (173) Google Scholar). Le pourcentage d'AR a été déterminé dans une aliquote de 30 μl en ajoutant un volume égal de formaldéhyde à 10% dans une solution saline tamponnée au phosphate. Après la fixation, des aliquotes de 10 μl de la suspension de sperme ont été étalées sur des lames de verre et séchées à l'air. Les lames ont été colorées avec 0,22 % de bleu de Coomassie G-250 dans 50 % de méthanol et 10 % d'acide acétique glacial pendant ∼5 min, rincées et montées avec 50 % (v/v) de glycérol dans une solution saline tamponnée au phosphate (5Munoz-Garay C. De la Vega-Beltran J.L. Delgado R. Labarca P. Felix R. Darszon A. Dev. Biol. 2001 ; 234: 261-274Crossref PubMed Scopus (83) Google Scholar). Au moins 100 spermatozoïdes ont été testés par condition expérimentale pour calculer le pourcentage de RA. Analyse statistique - Les données sont exprimées en moyenne ± S.E. Les moyennes ont été comparées à l'aide d'un test t de Student non apparié, et p < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif. CFTR est présent dans le sperme de mammifère - CFTR module plusieurs processus cellulaires, interagissant avec divers canaux et transporteurs ioniques, en particulier avec les ENaC (14Guggino W.B. Stanton B.A. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2006 ; 7: 426-436Crossref PubMed Scopus (350) Google Scholar, 32Sheppard D.N. Welsh M.J. Physiol. Rév. 1999 ; 79 (-S45) : S23Crossref PubMed Scopus (813) Google Scholar). Nous avons signalé la présence de sous-unités αENaC et δENaC dans le sperme de souris (8Hernandez-Gonzalez E.O. Sosnik J. Edwards J. Acevedo J.J. Mendoza-Lujambio I. Lopez-Gonzalez I. Demarco I. Wertheimer E. Darszon A. Visconti P.E. J. Biol. Chem. 2006 ; 281: 5623-5633Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (102) Google Scholar) et ont maintenant trouvé la sous-unité αENaC dans le sperme humain (données non présentées). Nous avons examiné si le CFTR est présent dans les spermatozoïdes de souris et d'humains. Tout d'abord, la présence de transcrits CFTR a été analysée à l'aide de la transcription inverse-PCR ; l'ADNc a été synthétisé à partir de l'ARN total extrait de spermatozoïdes humains éjaculés et de cellules spermatogènes de souris purifiées (33Trevino C.L. Felix R. Castellano L.E. Gutierrez C. Rodriguez D. Pacheco J. Lopez-Gonzalez I. Gomora J.C. Tsutsumi V. Hernandez-Cruz A. Fiordelisio T. Scaling A.L. Darszon A. FEBS Lett. 2004 ; 563: 87-92Crossref PubMed Scopus (66) Google Scholar). Des amorces spécifiques pour CFTR ont été conçues en utilisant les séquences nucléotidiques rapportées chez l'homme et la souris pour ces gènes. Des fragments de CFTR de la longueur attendue ont été détectés à partir de sperme humain (476 pb) et de cellules spermatogènes de souris (581 pb) d'ADNc (Fig. 1A), et leurs identités ont été confirmées par séquençage de l'ADN. Étant donné que l'expression des transcrits CFTR dans les spermatides de souris et dans le sperme humain n'implique pas la présence de la protéine CFTR dans le sperme mature, des expériences de transfert Western et d'immunofluorescence ont été menées à l'aide d'un anticorps polyclonal anti-CFTR. Cet anticorps a détecté une bande protéique au poids moléculaire attendu dans le sperme humain et de souris, ainsi que dans des extraits entiers de poumon de souris qui ont été inclus en tant que contrôle positif (Fig. Dans tous ces cas, la préincubation avec le peptide antigénique CFTR a éliminé le signal Western blot (Fig. 1B). En utilisant le même anticorps, le CFTR a été immunolocalisé sur la pièce médiane de l'humain (Fig. 1C) et le sperme de souris (Fig. 1E). Il convient de noter que αENaC localisé dans la même région spermatique (8Hernandez-Gonzalez E.O. Sosnik J. Edwards J. Acevedo J.J. Mendoza-Lujambio I. Lopez-Gonzalez I. Demarco I. Wertheimer E. Darszon A. Visconti P.E. J. Biol. Chem. 2006 ; 281: 5623-5633Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (102) Google Scholar). L'incubation précédente de l'anticorps avec le peptide antigénique respectif a bloqué le signal d'immunofluorescence (Fig. 1, D et F). Le CFTR est impliqué dans l'hyperpolarisation associée à la capacitation - Étant donné que le CFTR est un canal Cl-, il peut contribuer au repos du sperme de souris Em et aux changements qu'il subit pendant la capacitation. Il est intéressant de noter que le DPC de 250 μm, qui inhibe le CFTR, a pu bloquer l'hyperpolarisation associée à la capacitation sans affecter l'EM du sperme incubé dans des conditions qui ne supportent pas la capacitation (Fig. 2) D'autre part, les spermatozoïdes non-capacités incubés 10 min avec de la génistéine 10 μm, un composé qui active le CFTR, subissent une hyperpolarisation supérieure à celle qui accompagne la capacitation. Notamment, l'hyperpolarisation induite par la génistéine a été bloquée par DPC. Ces résultats indiquent que l'activation du CFTR influence le sperme Em (Fig. 2, A et B). Le CFTR participe à la capacitation - Compte tenu du fait que le DPC a bloqué l'hyperpolarisation associée à la capacitation, nous avons examiné si l'inhibition du CFTR était également capable de bloquer le processus de capacitation. Deux protocoles expérimentaux ont été utilisés. 1) Les spermatozoïdes de souris ont été capacités en présence ou en l'absence de 250 μm DPC, puis la RA a été induite en ajoutant de la ZP. 2) Les spermatozoïdes ont été capacités en l'absence de DPC, puis incubés pendant 5 min avec du DPC, juste avant l'induction o

Los espermatozoides de los mamíferos adquieren capacidad fertilizante en el tracto femenino durante un proceso conocido como capacitación. En el esperma de ratón, este proceso se asocia con aumentos en la fosforilación de la tirosina de la proteína, hiperpolarización del potencial de membrana, aumento en el pH intracelular y Ca2+, y motilidad hiperactivada. Los mecanismos moleculares implicados en estos cambios no se conocen completamente. La evidencia actual sugiere que en los espermatozoides de ratón la hiperpolarización de la membrana asociada a la capacitación está regulada por una vía dependiente de AMPc/proteína quinasa A que implica la activación de los canales de K+ que se rectifican hacia adentro y la inhibición de los canales de sodio epiteliales (ENaC). El regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) es un canal de Cl- que controla la actividad de varias proteínas de transporte, incluidas las ENaC. Aquí exploramos si CFTR está involucrado en la regulación de la inhibición de ENaC en los espermatozoides y, por lo tanto, es esencial para la hiperpolarización asociada a la capacitación. Utilizando PCR de transcripción inversa, transferencia Western e inmunocitoquímica, documentamos la presencia de CFTR en espermatozoides de ratón y humanos. Curiosamente, la adición de un inhibidor de CFTR (ácido difenilamina-2-carboxílico; 250 μm) inhibió la hiperpolarización asociada a la capacitación, impidió el cierre de ENaC y disminuyó la reacción del acrosoma inducida por la zona pelúcida sin afectar el aumento de la fosforilación de la tirosina. La incubación de espermatozoides en medio libre de Cl- también eliminó la hiperpolarización asociada a la capacitación. Por otro lado, un activador de CFTR (genisteína; 5-10 μm) promovió la hiperpolarización en espermatozoides de ratón incubados en condiciones que no admiten la capacitación. La adición de AMP cíclico de dibutirilo a espermatozoides de ratón no capacitados elevó el Cl- intracelular. Estos resultados sugieren que los flujos de Cl- dependientes de cAMP a través de CFTR están involucrados en la regulación de ENaC durante la capacitación y, por lo tanto, contribuyen a la hiperpolarización observada asociada con este proceso. Los espermatozoides de los mamíferos adquieren capacidad fertilizante en el tracto femenino durante un proceso conocido como capacitación. En el esperma de ratón, este proceso se asocia con aumentos en la fosforilación de la tirosina de la proteína, hiperpolarización del potencial de membrana, aumento en el pH intracelular y Ca2+, y motilidad hiperactivada. Los mecanismos moleculares implicados en estos cambios no se conocen completamente. La evidencia actual sugiere que en los espermatozoides de ratón la hiperpolarización de la membrana asociada a la capacitación está regulada por una vía dependiente de AMPc/proteína quinasa A que implica la activación de los canales de K+ que se rectifican hacia adentro y la inhibición de los canales de sodio epiteliales (ENaC). El regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) es un canal de Cl- que controla la actividad de varias proteínas de transporte, incluidas las ENaC. Aquí exploramos si CFTR está involucrado en la regulación de la inhibición de ENaC en los espermatozoides y, por lo tanto, es esencial para la hiperpolarización asociada a la capacitación. Utilizando PCR de transcripción inversa, transferencia Western e inmunocitoquímica, documentamos la presencia de CFTR en espermatozoides de ratón y humanos. Curiosamente, la adición de un inhibidor de CFTR (ácido difenilamina-2-carboxílico; 250 μm) inhibió la hiperpolarización asociada a la capacitación, impidió el cierre de ENaC y disminuyó la reacción del acrosoma inducida por la zona pelúcida sin afectar el aumento de la fosforilación de la tirosina. La incubación de espermatozoides en medio libre de Cl- también eliminó la hiperpolarización asociada a la capacitación. Por otro lado, un activador de CFTR (genisteína; 5-10 μm) promovió la hiperpolarización en espermatozoides de ratón incubados en condiciones que no admiten la capacitación. La adición de AMP cíclico de dibutirilo a espermatozoides de ratón no capacitados elevó el Cl- intracelular. Estos resultados sugieren que los flujos de Cl- dependientes de cAMP a través de CFTR están involucrados en la regulación de ENaC durante la capacitación y, por lo tanto, contribuyen a la hiperpolarización observada asociada con este proceso. La capacitación de los espermatozoides es un fenómeno complejo requerido para la fertilización. En el esperma de ratón, la capacitación incluye la reorganización de la membrana plasmática, el aumento de la fosforilación de la proteína tirosina, la hiperpolarización del potencial de la membrana plasmática (Em), 2Las abreviaturas utilizadas son: Em, potencial de la membrana plasmática; AR, reacción del acrosoma; ZP, zona pelúcida; ENaC, canal de sodio epitelial; PKA, proteína quinasa A; CFTR, regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística; Bt2cAMP, AMP cíclico de dibutirilo; IBMX, 3-isobutil-1-metilxantina; MQAE, bromuro de N-(etoxicarbonilmetil) -6-metoxiquinolinio; DiSC3 (5), yoduro de 3,3′ -dipropiltiadicarbocianina; SITS, ácido 4-acetomido-4 ′-isotiocianatostilbeno-2,2 ′-disulfónico; TRITC, isotiocianato de tetrametilrodamina; DPC, ácido difenilamina-2-carboxílico; WH, amortiguado con HEPES de Whitten. y aumenta el pH intracelular (pHi) y Ca2+ [Ca2+] + i) (revisado en Refs. 1Darszon A. Nishigaki T. Wood C. Trevino C.L. Felix R. Beltran C. Int. Rev. Cytol. 2005; 243: 79-172Crossref PubMed Scopus (139) Google Scholar y 2Visconti p.e. Westbrook V.A. Chertihin O. Demarco I. Sleight S. Diekman A.B. J. Reprod. Immunol. 2002; 53: 133-150Crossref PubMed Scopus (290) Google Scholar). La capacitación también se asocia con la aparición de motilidad hiperactivada (3Yanagimachi R. Knobile E. Neill J.D. The Physiology of Reproduction. 1. 1994: 189-317Google Scholar). Todos estos cambios preparan a los espermatozoides para alcanzar y penetrar eficazmente en las capas externas del óvulo y someterse a la reacción del acrosoma (AR) (4Florman H.M. Arnoult C. Kazam I.G. Li C. O'Toole C.M. Biol. Reprod. 1998; 59: 12-16Crossref PubMed Scopus (166) Google Scholar). Entre los cambios observados durante la capacitación de espermatozoides de ratón, se ha propuesto que la hiperpolarización que tiene lugar durante este proceso desempeña el importante papel de eliminar la inactivación de los canales de Ca2+ dependientes de voltaje, de modo que se abran a una despolarización inducida por una zona pelúcida (ZP) y desencadenen el RA. Poco se sabe sobre las entidades moleculares que participan en esta hiperpolarización y cómo todos los cambios asociados a la capacitación se combinan para promover la capacitación. Se han propuesto varios candidatos para participar en la hiperpolarización inducida por la capacitación. Los estudios de nuestro grupo han demostrado que los canales de K+ que se rectifican hacia adentro contribuyen a esta hiperpolarización (5Munoz-Garay C. De la Vega-Beltran J.L. Delgado R. Labarca P. Felix R. Darszon A. Dev. Biol. 2001; 234: 261-274Crossref PubMed Scopus (83) Google Scholar, 6Acevedo J.J. Mendoza-Lujambio I. de la Vega-Beltran J.L. Trevino C.L. Felix R. Darszon A. Dev. Biol. 2006; 289: 395-405Crossref PubMed Scopus (45) Google Scholar). Además, documentamos que un cotransportador electrogénico de Na+/HCO3− hiperpolariza el esperma de ratón cuando se eleva el HCO3− externo (7DEMARCO I.A. Espinosa F. Edwards J. Sosnik J. De La Vega-Beltran J.L. Hockensmith J.W. Kopf G.S. Darszon A. Visconti p.e. J. Biol. Chem. 2003; 278: 7001-7009Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (176) Google Scholar). Además, recientemente informamos la presencia de canales epiteliales de Na+ (ENaC) en los espermatozoides de ratón y demostramos que una reducción en la permeabilidad del Na+ de los espermatozoides es esencial para la hiperpolarización asociada a la capacitación (8Hernandez-Gonzalez E.O. Sosnik J. Edwards J. Acevedo J. Mendoza-Lujambio I. Lopez-Gonzalez I. Demarco I. Wertheimer E. Darszon A. Visconti p.e. J. Biol. Chem. 2006; 281: 5623-5633Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (102) Google Scholar). Este trabajo posterior sugiere fuertemente que los espermatozoides de ratón (ENaC) son constitutivamente activos en los espermatozoides no capacitados y se cierran durante la capacitación, lo que resulta en la hiperpolarización de Em. Curiosamente, los experimentos en este trabajo sugieren que el cierre de ENaC está regulado directa o indirectamente por una vía dependiente de cAMP/proteína quinasa A (PKA) (8Hernandez-González E.O. Sosnik J. Edwards J. Acevedo J.J. Mendoza-Lujambio I. Lopez-González I. Demarco I. Wertheimer E. Darszon A. Visconti p.e. J. Biol. Chem. 2006; 281: 5623-5633Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (102) Google Scholar). El regulador de la conductancia transmembrana de la fibrosis quística (CFTR) es un canal de Cl- modulado por AMPc y un regulador de varios transportadores y proteínas, incluidos los canales de K+, como ROMK1 y ROMK2 (9Kunzelmann K. Schreiber R. J. Membr. Biol. 1999; 168: 1-8Crossref PubMed Scopus (95) Google Scholar, 10Liu X. Singh B.B. Ambudkar I.S. J. Biol. Chem. 1999; 274: 25121-25129Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (29) Google Scholar), intercambiadores aniónicos, acuaporinas y ENaC (11Briel M. Greger R. Kunzelmann K. J. Physiol. (Lond.). 1998; 508: 825-836Crossref Scopus (115) Google Scholar). En los conductos sudoríparas que absorben sal, la activación de CFTR causa estimulación ENaC (12Nagel G. Szellas T. Riordan J.R. Friedrich T. Hartung K. EMBO Rep. 2001; 2: 249-254Crossref PubMed Scopus (51) Google Scholar). En otros tejidos que son absorbentes o secretores, dependiendo de la necesidad fisiológica, la activación de CFTR inhibe recíprocamente las ENaC (13Schwiebert E.M. Benos D.J. Egan M.E. Stutts M.J. Guggino W.B. Physiol. Rev. 1999; 79: 145-166Crossref PubMed Scopus (379) Google Scholar). La fibrosis quística, la enfermedad genética humana más prevalente, es causada por mutaciones de CFTR (14Guggino W.B. Stanton B.A. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2006; 7: 426-436 Crossref PubMed Scopus (350) Google Scholar). Además, la participación de CFTR en la infertilidad masculina y femenina ha sido reconocida durante mucho tiempo (15Jarzabek K. Zbucka M. Pepinski W. Szamatowicz J. Domitrz J. Janica J. Wolczynski S. Szamatowicz M. Reprod. Biol. 2004; 4: 119-129PubMed Google Scholar). Casi todos los hombres con fibrosis quística son infértiles debido a una ausencia bilateral congénita de la deferencia del conducto. Recientemente, Chan et al. (16Chan H.C. Shi Q.X. Zhou C.X. Wang X.F. Xu W.M. Chen W.Y. Chen A.J. Ni Y. Yuan Y.Y. Mol. Cell. Endocrinol. 2006; 250: 106-113Crossref PubMed Scopus (62) Google Scholar) propusieron que la permeación de HCO3- a través de CFTR (17Poulsen J.H. Fischer H. Illek B. Machen T.E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 5340-5344Crossref PubMed Scopus (365) Google Scholar) presente en las células endometriales juega un papel durante la capacitación de espermatozoides in vivo y puede explicar algunos casos de infertilidad por fibrosis quística femenina. Este hallazgo es consistente con el requisito de HCO3− para la capacitación. Se han explorado varios modos de regulación de CFTR, que incluyen fosforilación, niveles de Cl y ATP, Em e interacción directa proteína-proteína (12Nagel G. Szellas T. Riordan J.R. Friedrich T. Hartung K. EMBO Rep. 2001; 2: 249-254Crossref PubMed Scopus (51) Google Scholar, 18Kunzelmann K. Kiser G.L. Schreiber R. Riordan J.R. FEBS Lett. 1997; 400: 341-344 Crossref PubMed Scopus (130) Google Scholar, 19Reddy M.M. Quinton P.M. Am. J. Physiol. 2006; 291 (-C129): C122Crossref Scopus (15) Google Scholar). Curiosamente, CFTR y ENaC se colocalizan y pueden interactuar en varios tejidos (14Guggino W.B. Stanton B.A. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2006; 7: 426-436 Crossref PubMed Scopus (350) Google Scholar). En este trabajo, documentamos la presencia de CFTR tanto en espermatozoides de ratón como humanos y demostramos que el ácido difenilamina-2-carboxílico (DPC), un inhibidor de CFTR, bloquea la hiperpolarización asociada a la capacitación. Además, la genisteína, un activador de los canales CFTR, hiperpolarizó los espermatozoides en condiciones que no admiten la capacitación. Estos cambios inducidos por genisteína en Em fueron inhibidos por DPC. Dado que CFTR es un canal de Cl-, utilizamos la sonda fluorescente de Cl- bromuro de N-(etoxicarbonilmetil) -6-metoxiquinolinio (MQAE) para determinar la concentración intracelular de Cl- ([Cl-]i) de esperma de ratón no capacitado y exploramos la influencia de los reguladores de CFTR en este parámetro. La adición de genisteína, así como análogos de cAMP, promovió la afluencia de Cl- en espermatozoides no capacitados que fueron bloqueados por DPC. Teniendo en cuenta que el cierre de ENaC en los espermatozoides está regulado por una vía de AMPc, planteamos la hipótesis de que la regulación de CFTR del Em de los espermatozoides podría estar mediada por ENaC. De acuerdo con esta hipótesis, la genisteína disminuyó la hiperpolarización inducida por amilorida y la permeabilidad de Na+ sensible a amilorida en espermatozoides no capacitados que habíamos informado anteriormente (8Hernandez-Gonzalez E.O. Sosnik J. Edwards J. Acevedo J.J. Mendoza-Lujambio I. Lopez-Gonzalez I. Demarco I. Wertheimer E. Darszon A. Visconti p.e. J. Biol. Chem. 2006; 281: 5623-5633Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (102) Google Scholar), lo que sugiere que CFTR regula la hiperpolarización asociada a la capacitación en espermatozoides de ratón a través de la inhibición de ENaC. Materiales: Amilorida, AMP cíclico de dibutirilo (Bt2cAMP), 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), cianuro de carbonilo, m-clorofenilhidrazona, valinomicina, nigericina, gluconato de sodio y gluconato de potasio se adquirieron de Sigma. MQAE, yoduro de 3,3′ -dipropiltiadicarbocianina (DiSC3 (5)), ácido4-acetomido-4 ′ -isotiocianatoestilbeno-2,2′-disulfónico (SITS) SE obtuvieron de Invitrogen. El anticuerpo policlonal contra CFTR se adquirió de Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). La IgG anti-cabra de ratón conjugada con biotina y la avidina conjugada con TRITC eran de Pierce. DPC era de Sigma. Se prepararon DPC (stock de 10 mm), genisteína, DiSC3 (5), cianuro de carbonilo, m-clorofenilhidrazona y valinomicina (stocks de 1 mm) en Me2SO y se almacenaron a -20 °C hasta su uso. Se prepararon Bt2cAMP (1 mm), H-89 e IBMX (100 μm) el día del experimento utilizando un medio Krebs-Ringer modificado (medio amortiguado con HEPES (WH) de Whitten) (20Moore G.D. Ayabe T. Visconti p.e. Schultz R.M. Kopf G.S. Development. 1994; 120: 3313-3323 Crossref PubMed Google Scholar) y se utiliza en la concentración indicada. Preparación de espermatozoides: los protocolos experimentales fueron aprobados por el Comité local de Cuidado y Bioética Animal del Instituto de Biotecnología-Universidad Nacional Autónoma de México. En la mayoría de los experimentos, se recogieron espermatozoides de ratón epididimario cauda de reproductores masculinos retirados CD1 colocando epidídimo cauda picado en medio WH. Este medio no admite la capacitación a menos que se complemente con 5 mg/ml de albúmina de suero bovino y NaHCO3 de 24 mm. Después de 10 min, la suspensión de esperma se lavó en 10 ml del mismo medio mediante centrifugación a 800 × g durante 10 min a temperatura ambiente. A continuación, los espermatozoides se resuspendieron a una concentración final de 2 × 107 células/ml y se diluyeron 10 veces en el medio apropiado dependiendo del experimento. Para estudiar el papel de Cl- en la capacitación y en la regulación de Em, NaCl y KCl fueron reemplazados por gluconato de sodio y gluconato de potasio, respectivamente. Preparación de espermatozoides humanos: se obtuvo semen de voluntarios normales y fértiles mediante masturbación después de al menos 2 días de abstinencia. Después de la licuefacción, se aplicó 1 ml de Ham 's F-10 a 1 ml de semen para permitir que los espermatozoides móviles nadaran hacia la capa superior de la suspensión (1 h a 37 °C). Se recogieron espermatozoides nadadores y se ajustaron a 1 × 106 células/ml. Las muestras se utilizaron para el análisis de transferencia Western y el análisis de inmunofluorescencia indirecta como se describe para los espermatozoides de ratón. Aislamiento de ARN y experimentos de PCR de transcripción inversa: se preparó ARN total a partir de espermátidas alargadas de ratón aisladas (21Bellve A.R. Methods Enzymol. 1993; 225: 84-113 Crossref PubMed Scopus (300) Google Scholar) o esperma humano eyaculado, utilizando el reactivo TRIzol (Sigma) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc se sintetizó a partir de muestras de ARN total con transcripción inversa cebada con hexámero aleatorio (transcriptasa inversa RNasa H Superscript II; Invitrogen). El ADNc se sometió luego a amplificación por PCR utilizando TaqDNA polimerasa (Invitrogen). Los cebadores de la subunidad CFTR se diseñaron utilizando la secuencia de nucleótidos informada humana y de ratón para estos genes (CFTR NM_020038 humano y CFTR NM_021050 de ratón, respectivamente). Las secuencias de cebadores para CFTR humano son las siguientes: directo, 5'-ATG ATT ATG GGA GAA CTG G-3; inverso, 5'-ATG AGA AAC GGT GTA AGG T-3'. Las secuencias de cebadores para CFTR de ratón son las siguientes: directo, 5'-GGA GCA AAC CCA AAC A-3'; inverso, 5'-AGC AGC CAC CTC AAC C-3'. La ausencia de contaminación genómica en las muestras de ARN se confirmó con controles negativos para la transcripción inversa (sin transcripción inversa) para cada experimento. Los productos amplificados se analizaron mediante secuenciación de ADN para confirmar su identidad. SDS-PAGE e inmunotransferencia: se obtuvieron extractos de esperma humano y de ratón mediante el método descrito por la Ref. 22Hernández-González E.O. Lecona-Valera A.N. Escobar-Herrera J. Mujica A. Cell Motil. Cytoskeleton. 2000; 46: 43-58Crossref PubMed Scopus (46) Google Scholar. Los espermatozoides se resuspendieron en tampón de muestra que contenía inhibidores de proteasa sin 2-mercaptoetanol y se hirvieron durante 5 min. Las muestras de esperma se centrifugaron a 10.000 × g durante 15 min. Después de la centrifugación, se recogieron los sobrenadantes y se añadió 2-mercaptoetanol a una concentración final del 5% (v/v). Las muestras se hirvieron durante 5 minutos adicionales y luego se sometieron a SDS-PAGE al 10% (23Laemmli U.K. Nature. 1970; 227: 680-685 Crossref PubMed Scopus (207537) Google Scholar). La electrotransferencia de proteínas a Immobilon P (Bio-Rad) y la inmunodetección de CFTR se llevó a cabo como se describió anteriormente (24Kalab P. Visconti P. Leclerc P. Kopf G.S. J. Biol. Chem. 1994; 269: 3810-3817Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Las inmunotransferencias se incubaron con anti-CFTR y se desarrollaron con el anticuerpo secundario apropiado conjugado con peroxidasa de rábano picante (Sigma) y el kit ECL quimioluminiscente (Amersham Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Inmunofluorescencia indirecta: las suspensiones de esperma se fijaron en paraformaldehído (concentración final del 4%) durante 30 min a temperatura ambiente, se lavaron mediante centrifugación a 800 × g durante 5 min, se permeabilizaron en PBS-Triton X-100 (concentración final del 0,05%) durante 15 min a temperatura ambiente y se lavaron tres veces con PBS. Se añadieron anticuerpos primarios específicos a las muestras de esperma y se incubaron durante la noche a 4 °C, se lavaron tres veces con PBS y luego se incubaron con el anticuerpo secundario apropiado (IgG anti-conejo conjugado con biotina) durante 1 h a 37 °C. A continuación, el anticuerpo secundario se sometió a tres lavados consecutivos con PBS y se desarrolló mediante incubación con isotiocianato de avidina-fluoresceína diluido en tampón HEPES-solución salina (HEPES 20 mm y NaCl 100 mm, pH 8,2) durante 1 h a 37 °C. Finalmente, las muestras se lavaron y se montaron en PBS-glicerol (SlowFade, Molecular Probes) y se examinaron utilizando un microscopio confocal. Ensayo de Potencial de Membrana en Poblaciones de Espermatozoides-Em se midió como se describió anteriormente (7Demarco I.A. Espinosa F. Edwards J. Sosnik J. De La Vega-Beltran J.L. Hockensmith J.W. Kopf G.S. Darszon A. Visconti p.e. J. Biol. Chem. 2003; 278: 7001-7009Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (176) Google Scholar). Brevemente, los espermatozoides se recolectaron como se indicó anteriormente, se diluyeron en el medio apropiado y se capacitaron durante diferentes períodos de tiempo dependiendo del experimento. Ocho minutos antes de la medición, se añadió 1 μm de DiSC3 (5) (concentración final) a la suspensión de esperma y se incubó adicionalmente durante 5 minutos a 37 °C. Luego se añadió un μm de cianuro de carbonilo m-clorofenilhidrazona (concentración final) para colapsar el potencial mitocondrial, y los espermatozoides se incubaron durante 2 minutos adicionales. Después de este período, se transfirieron 1,5 ml de la suspensión a una cubeta suavemente agitada a 37 °C, y se registró continuamente la fluorescencia (excitación/emisión de 620/670 nm). La calibración se realizó como se ha descrito anteriormente añadiendo 1 μm de valinomicina y adiciones secuenciales de KCl. Despolarización inducida por Na+ e hiperpolarización inducida por amilorida: después de alcanzar la fluorescencia en estado estacionario, se añadió NaCl 50 mm mientras se registraba la fluorescencia en presencia o ausencia de diferentes compuestos como se indica en cada figura. Después de alcanzar un nuevo estado estacionario fluorescente, se realizó la calibración como se indicó anteriormente. Se cuantificaron los cambios de Em provocados por NaCl, teniendo en cuenta la curva de calibración y la fluorescencia inicial en estado estacionario antes de la adición de NaCl. Los controles para determinar si la amilorida o su solvente (Me2SO) alteraron la fluorescencia deDiSC3 (5) se realizaron solo con colorante y no mostraron cambios significativos en la fluorescencia (datos no mostrados). Mediciones intracelulares de Cl- en poblaciones de espermatozoides- [Cl-]i se midió en poblaciones de espermatozoides utilizando un colorante fluorescente sensible al Cl- (MQAE) (25VERKMAN A.S. Sellers M.C. Chao A.C. Leung T. Ketcham R. Anal. Biochem. 1989; 178: 355-361Crossref PubMed Scopus (179) Google Scholar). Los espermatozoides se incubaron con MQAE 10 mm durante 30 min a 37 °C. El exceso de MQAE se eliminó diluyendo el esperma 10 veces con medio libre de WH-Cl (gluconato de sodio 100 mm, gluconato de potasio 4.4 mm, KH2PO4 1.2 mm, MgSO4 1.2 mm, glucosa 5.4 mm, ácido pirúvico 0.8 mm, ácido láctico 4.8 mm, HEPES 20 mm, pH 7.2) y centrifugando durante 3 min a 300 × g. El sedimento de esperma se resuspendió en alícuotas de 2 x 106 espermatozoides/ml con medio en las siguientes condiciones. 1) Para obtener la fluorescencia máxima (Fmax), se utilizó medio libre de WH-Cl con nigericina (10 μm) y tributilestaño (10 μm). 2) Para determinar la fluorescencia a concentraciones definidas de Cl- (FCl-), se mezclaron dos medios (WH que contenía diferentes concentraciones de NaCl (10-100 mm) y medio libre de WH-Cl- manteniendo Cl- + gluconato- = 100 mm); también se añadieron nigericina (10 μm) y tributilestaño (10 μm). 3) Para la fluorescencia mínima (Fmin), se utilizó 150 mm de KSCN amortiguado con 10 mm de HEPES (pH 7.2) y 5 μm de valinomicina. Las muestras se iluminaron a 350 nm y la emisión se recogió a 450 nm. La relación entre la concentración de Cl- y la intensidad de fluorescencia de MQAE expresada como la relación F0/FCl- proporciona una línea recta con una pendiente igual a Kq, la constante de Stern-Volmer, donde la señal apagable total F0 se define por Fmax - Fmin. [Cl-]i se estimó utilizando la parcela construida (25Verkman A.S. Sellers M.C. Chao A.C. Leung T. Ketcham R. Anal. Biochem. 1989; 178: 355-361Crossref PubMed Scopus (179) Google Scholar, 26Inglefield J.R. Schwartz-Bloom R.D. Methods. 1999; 18: 197-203 Crossref PubMed Scopus (28) Google Scholar, 27 Jayaraman S. Biwersi J. Verkman A.S. Am. J. Physiol. 1999; 276 (-C757): C747Crossref PubMed Google Scholar). El espermatozoide [Cl-]i también se evaluó de acuerdo con García y Meizel (28Garcia M.A. Meizel S. J. Androl. 1999; 20: 88-93PubMed Google Scholar). Los espermatozoides de ratón se incubaron durante 30 min en medio WH que contenía diferentes concentraciones de Cl- (0-100 mm) y 10 mm de MQAE. El exceso de MQAE se eliminó como se mencionó anteriormente, y los datos de intensidad de fluorescencia de emisión de las suspensiones de esperma (2 × 106 espermatozoides/ml) se registraron durante 120 s. El [Cl-] intracelular y extracelular se equilibraron permeabilizando la membrana espermática con digitonina (10 μm), y la fluorescencia se registró durante otros 120 s. El [Cl-]i se calculó según lo descrito por García y Meizel (28Garcia M.A. Meizel S. J. Androl. 1999; 20: 88-93PubMed Google Scholar). Es importante tener en cuenta que los valores de [Cl-]i deben tomarse con precaución, ya que se obtienen de una población de espermatozoides heterogénea. Las determinaciones de Cl- requieren una calibración, que asume que el colorante se comporta en el esperma como en otras células (24Kalab P. Visconti P. Leclerc P. Kopf G.S. J. Biol. Chem. 1994; 269: 3810-3817Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 25Verkman A.S. Sellers M.C. Chao A.C. Leung T. Ketcham R. Anal. Biochem. 1989; 178: 355-361Crossref PubMed Scopus (179) Google Scholar, 26Inglefield J.R. Schwartz-Bloom R.D. Methods. 1999; 18: 197-203 Crossref PubMed Scopus (28) Google Scholar) y no corrige el colorante externo residual y algunas diferencias en las condiciones experimentales. Solo es posible lavar los espermatozoides de ratón una vez por centrifugación, ya que pierden viabilidad si se centrifugan más. La influencia de diferentes fármacos (es decir, genisteína, cAMP/IBMX, DPC, H-89 y SITS) en [Cl-]i SE determinó utilizando suspensiones de esperma cargadas con MQAE como se describió anteriormente, después de registrar la fluorescencia basal durante 1-3 minutos y medir durante 5-10 minutos adicionales. Se realizaron dos controles: 1) se añadieron solventes de fármaco (Me2SO o agua) mientras se registraba la fluorescencia, y 2) se registró la fluorescencia de MQAE sin células, y se añadieron los fármacos. No se observaron cambios de fluorescencia significativos después de realizar ambos controles (datos no mostrados). Los cambios de [Cl-]i se estimaron como se describió anteriormente. Ensayo de reacción de acrosomas: se recogieron espermatozoides de ratón epididimario audal de ratones CD1 y se colocaron en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml tapados que contenían medio 199 (Sigma) complementado con albúmina de suero bovino (0,4%, p/v), piruvato de Na+ (30 mg/litro) y NaHCO3 (2,2 g/litro) a 37 °C (4-5 × 106 células/ml). The swim-up method (29Henkel R.R. Schill W.B. Reprod. Biol. Endocrinol. 2003; 1: 108Crossref PubMed Scopus (380) Google Scholar) para separar espermatozoides con >90% de motilidad. La suspensión de esperma se incubó 10 min, y la parte superior ~1 ml se separó y se capacitó durante 30 min a 37 °C (30 Visconti p.e. Galantino-Homer H. Ning X. Moore G.D. Valenzuela J.P. Jorgez C.J. Alvarez J.G. Kopf G.S. J. Biol. Chem. 1999; 274: 3235-3242Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (271) Google Scholar). La AR se indujo después de la capacitación (en presencia o ausencia de DPC) en una alícuota de 30 μl mediante la adición de 5 ZP eq/μl o 15 μm A23187. ZP se obtuvo de ovocitos de ratón (31Cross N.L. Meizel S. Biol. Reprod. 1989; 41: 635-641Crossref PubMed Scopus (173) Google Scholar). El porcentaje de AR se determinó en una alícuota de 30 μl mediante la adición de un volumen igual de formaldehído al 10% en solución salina tamponada con fosfato. Después de la fijación, se extendieron alícuotas de 10 μl de la suspensión de esperma sobre portaobjetos de vidrio y se secaron al aire. Los portaobjetos se tiñeron con azul de Coomassie G-250 al 0,22% en metanol al 50% y ácido acético glacial al 10% durante ~5 min, se enjuagaron y se montaron con glicerol al 50% (v/v) en solución salina tamponada con fosfato (5Munoz-Garay C. De la Vega-Beltran J.L. Delgado R. Labarca P. Felix R. Darszon A. Dev. Biol. 2001; 234: 261-274Crossref PubMed Scopus (83) Google Scholar). Se analizaron al menos 100 espermatozoides por condición experimental para calcular el porcentaje de AR. Análisis estadístico: los datos se expresan como media ± S.E. Las medias se compararon utilizando una prueba t de Student no pareada, y p < 0.05 se consideró estadísticamente significativa. CFTR está presente en espermatozoides de mamíferos: CFTR modula varios procesos celulares, interactuando con varios canales y transportadores iónicos, particularmente con ENaC (14Guggino W.B. Stanton B.A. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2006; 7: 426-436 Crossref PubMed Scopus (350) Google Scholar, 32Sheppard D.N. Welsh M.J. Physiol. Rev. 1999; 79 (-S45): S23Crossref PubMed Scopus (813) Google Scholar). Reportamos la presencia de subunidades αENaC y δENaC en espermatozoides de ratón (8Hernandez-González E.O. Sosnik J. Edwards J. Acevedo J.J. Mendoza-Lujambio I. Lopez-González I. Demarco I. Wertheimer E. Darszon A. Visconti p.e. J. Biol. Chem. 2006; 281: 5623-5633Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (102) Google Scholar) y ahora han encontrado la subunidad αENaC en el esperma humano (datos no mostrados). Examinamos si CFTR está presente en espermatozoides de ratón y humanos. En primer lugar, se analizó la presencia de transcritos de CFTR mediante transcripción inversa-PCR; se sintetizó ADNc a partir de ARN total extraído de eyaculados de espermatozoides humanos y células espermatogénicas de ratón purificadas (33Trevino C.L. Felix R. Castellano L.E. Gutierrez C. Rodriguez D. Pacheco J. Lopez-Gonzalez I. Gomora J.C. Tsutsumi V. Hernandez-Cruz A. Fiordelisio T. Scaling A.L. Darszon A. FEBS Lett. 2004; 563: 87-92 Crossref PubMed Scopus (66) Google Scholar). Se diseñaron cebadores específicos para CFTR utilizando las secuencias de nucleótidos humanas y de ratón informadas para estos genes. Se detectaron fragmentos de CFTR de la longitud esperada de esperma humano (476 pb) y ADNc de células espermatogénicas de ratón (581 pb) (Fig. 1A), y sus identidades se confirmaron mediante secuenciación de ADN. Debido a que la expresión de transcritos de CFTR en espermátidas de ratón y en espermatozoides humanos no implica la presencia de la proteína CFTR en espermatozoides maduros, se realizaron experimentos de inmunofluorescencia y transferencia Western utilizando un anticuerpo policlonal anti-CFTR. Este anticuerpo detectó una banda de proteína al peso molecular esperado tanto en espermatozoides humanos como de ratón, así como en extractos completos de pulmón de ratón que se incluyeron como control positivo (Fig. 1B). En todos estos casos, la preincubación con el péptido antigénico CFTR eliminó la señal de transferencia Western (Fig. 1B). Usando el mismo anticuerpo, el CFTR se inmunolocalizó en la pieza media del ser humano (Fig. 1C) y espermatozoides de ratón (Fig. 1E). Vale la pena señalar que αENaC se localizó en la misma región espermática (8Hernandez-González E.O. Sosnik J. Edwards J. Acevedo J.J. Mendoza-Lujambio I. Lopez-González I. Demarco I. Wertheimer E. Darszon A. Visconti p.e. J. Biol. Chem. 2006; 281: 5623-5633Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (102) Google Scholar). La incubación previa del anticuerpo con el péptido antigénico respectivo bloqueó la señal de inmunofluorescencia (Fig. 1, D y F). El CFTR está involucrado en la hiperpolarización asociada a la capacitación: dado que el CFTR es un canal de Cl, puede contribuir a que el esperma del ratón descanse Em y a los cambios que experimenta durante la capacitación. Curiosamente, el DPC de 250 μm, que inhibe el CFTR, pudo bloquear la hiperpolarización asociada a la capacitación sin afectar el Em de los espermatozoides incubados en condiciones que no admiten la capacitación (Fig. 2). Por otro lado, los espermatozoides no capacitados incubados 10 min con genisteína de 10 μm, un compuesto que activa el CFTR, experimentan una hiperpolarización mayor que la que acompaña a la capacitación. En particular, la hiperpolarización inducida por genisteína fue bloqueada por DPC. Estos resultados indican que la activación de CFTR influye en el Em espermático (Fig. 2, A y B). El CFTR participa en la capacitación: teniendo en cuenta que el DPC bloqueó la hiperpolarización asociada a la capacitación, exploramos si la inhibición del CFTR también pudo bloquear el proceso de capacitación. Se utilizaron dos protocolos experimentales. 1) Los espermatozoides de ratón se capacitaron en presencia o ausencia de DPC de 250 μm, y luego se indujo el AR añadiendo ZP. 2) Los espermatozoides se capacitaron en ausencia de DPC y luego se incubaron durante 5 minutos con DPC, justo antes de la inducción o

Mammalian sperm acquire fertilizing ability in the female tract during a process known as capacitation. In mouse sperm, this process is associated with increases in protein tyrosine phosphorylation, membrane potential hyperpolarization, increase in intracellular pH and Ca2+, and hyperactivated motility. The molecular mechanisms involved in these changes are not fully known. Present evidence suggests that in mouse sperm the capacitation-associated membrane hyperpolarization is regulated by a cAMP/protein kinase A-dependent pathway involving activation of inwardly rectifying K+ channels and inhibition of epithelial sodium channels (ENaCs). The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a Cl- channel that controls the activity of several transport proteins, including ENaCs. Here we explored whether CFTR is involved in the regulation of ENaC inhibition in sperm and therefore is essential for the capacitation-associated hyperpolarization. Using reverse transcription-PCR, Western blot, and immunocytochemistry, we document the presence of CFTR in mouse and human sperm. Interestingly, the addition of a CFTR inhibitor (diphenylamine-2-carboxylic acid; 250 μm) inhibited the capacitation-associated hyperpolarization, prevented ENaC closure, and decreased the zona pellucida-induced acrosome reaction without affecting the increase in tyrosine phosphorylation. Incubation of sperm in Cl--free medium also eliminated the capacitation-associated hyperpolarization. On the other hand, a CFTR activator (genistein; 5-10 μm) promoted hyperpolarization in mouse sperm incubated under conditions that do not support capacitation. The addition of dibutyryl cyclic AMP to noncapacitated mouse sperm elevated intracellular Cl-. These results suggest that cAMP-dependent Cl- fluxes through CFTR are involved in the regulation of ENaC during capacitation and thus contribute to the observed hyperpolarization associated with this process. Mammalian sperm acquire fertilizing ability in the female tract during a process known as capacitation. In mouse sperm, this process is associated with increases in protein tyrosine phosphorylation, membrane potential hyperpolarization, increase in intracellular pH and Ca2+, and hyperactivated motility. The molecular mechanisms involved in these changes are not fully known. Present evidence suggests that in mouse sperm the capacitation-associated membrane hyperpolarization is regulated by a cAMP/protein kinase A-dependent pathway involving activation of inwardly rectifying K+ channels and inhibition of epithelial sodium channels (ENaCs). The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a Cl- channel that controls the activity of several transport proteins, including ENaCs. Here we explored whether CFTR is involved in the regulation of ENaC inhibition in sperm and therefore is essential for the capacitation-associated hyperpolarization. Using reverse transcription-PCR, Western blot, and immunocytochemistry, we document the presence of CFTR in mouse and human sperm. Interestingly, the addition of a CFTR inhibitor (diphenylamine-2-carboxylic acid; 250 μm) inhibited the capacitation-associated hyperpolarization, prevented ENaC closure, and decreased the zona pellucida-induced acrosome reaction without affecting the increase in tyrosine phosphorylation. Incubation of sperm in Cl--free medium also eliminated the capacitation-associated hyperpolarization. On the other hand, a CFTR activator (genistein; 5-10 μm) promoted hyperpolarization in mouse sperm incubated under conditions that do not support capacitation. The addition of dibutyryl cyclic AMP to noncapacitated mouse sperm elevated intracellular Cl-. These results suggest that cAMP-dependent Cl- fluxes through CFTR are involved in the regulation of ENaC during capacitation and thus contribute to the observed hyperpolarization associated with this process. Sperm capacitation is a complex phenomenon required for fertilization. In mouse sperm, capacitation includes reorganization of the plasma membrane, increase in protein tyrosine phosphorylation, hyperpolarization of the plasma membrane potential (Em), 2The abbreviations used are: Em, plasma membrane potential; AR, acrosome reaction; ZP, zona pellucida; ENaC, epithelial sodium channel; PKA, protein kinase A; CFTR, cystic fibrosis transmembrane conductance regulator; Bt2cAMP, dibutyryl cyclic AMP; IBMX, 3-isobutyl-1-methylxantine; MQAE, N-(ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxyquinolinium bromide; DiSC3(5), 3,3′-dipropylthiadicarbocyanine iodide; SITS, 4-acetomido-4′-isothiocyanatostilbene-2,2′-disulfonic acid; TRITC, tetramethylrhodamine isothiocyanate; DPC, diphenylamine-2-carboxylic acid; WH, Whitten's HEPES-buffered. and increases in intracellular pH (pHi) and Ca2+ ([Ca2+]i) (reviewed in Refs. 1Darszon A. Nishigaki T. Wood C. Trevino C.L. Felix R. Beltran C. Int. Rev. Cytol. 2005; 243: 79-172Crossref PubMed Scopus (139) Google Scholar and 2Visconti P.E. Westbrook V.A. Chertihin O. Demarco I. Sleight S. Diekman A.B. J. Reprod. Immunol. 2002; 53: 133-150Crossref PubMed Scopus (290) Google Scholar). Capacitation is also associated with the appearance of hyperactivated motility (3Yanagimachi R. Knobile E. Neill J.D. The Physiology of Reproduction. 1. 1994: 189-317Google Scholar). All of these changes prime sperm to effectively reach and penetrate the outer layers of the egg and to undergo the acrosome reaction (AR) (4Florman H.M. Arnoult C. Kazam I.G. Li C. O'Toole C.M. Biol. Reprod. 1998; 59: 12-16Crossref PubMed Scopus (166) Google Scholar). Among the changes observed during mouse sperm capacitation, the hyperpolarization that takes place during this process has been proposed to play the important role of removing inactivation from voltage-dependent Ca2+ channels such that they open upon a zona pellucida (ZP)-induced depolarization and trigger the AR. Little is known about the molecular entities that participate in this hyperpolarization and how all of the capacitation-associated changes are combined to promote capacitation. Several candidates have been proposed to participate in the capacitation-induced hyperpolarization. Studies from our group have demonstrated that inwardly rectifying K+ channels contribute to this hyperpolarization (5Munoz-Garay C. De la Vega-Beltran J.L. Delgado R. Labarca P. Felix R. Darszon A. Dev. Biol. 2001; 234: 261-274Crossref PubMed Scopus (83) Google Scholar, 6Acevedo J.J. Mendoza-Lujambio I. de la Vega-Beltran J.L. Trevino C.L. Felix R. Darszon A. Dev. Biol. 2006; 289: 395-405Crossref PubMed Scopus (45) Google Scholar). In addition, we documented that an electrogenic Na+/HCO3− cotransporter hyperpolarizes mouse sperm when external HCO3− is elevated (7Demarco I.A. Espinosa F. Edwards J. Sosnik J. De La Vega-Beltran J.L. Hockensmith J.W. Kopf G.S. Darszon A. Visconti P.E. J. Biol. Chem. 2003; 278: 7001-7009Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (176) Google Scholar). Furthermore, we recently reported the presence of epithelial Na+ channels (ENaCs) in mouse sperm and showed that a reduction in the sperm Na+ permeability is essential for the capacitation-associated hyperpolarization (8Hernandez-Gonzalez E.O. Sosnik J. Edwards J. Acevedo J.J. Mendoza-Lujambio I. Lopez-Gonzalez I. Demarco I. Wertheimer E. Darszon A. Visconti P.E. J. Biol. Chem. 2006; 281: 5623-5633Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (102) Google Scholar). This later work strongly suggests that mouse sperm (ENaCs) are constitutively active in noncapacitated sperm and close during capacitation, resulting in Em hyperpolarization. Interestingly, experiments in this work suggest that closing of ENaCs is regulated directly or indirectly by a cAMP/protein kinase A (PKA)-dependent pathway (8Hernandez-Gonzalez E.O. Sosnik J. Edwards J. Acevedo J.J. Mendoza-Lujambio I. Lopez-Gonzalez I. Demarco I. Wertheimer E. Darszon A. Visconti P.E. J. Biol. Chem. 2006; 281: 5623-5633Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (102) Google Scholar). The cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) is a cAMP-modulated Cl- channel and a regulator of several transporters and proteins, including K+ channels, such as ROMK1 and ROMK2 (9Kunzelmann K. Schreiber R. J. Membr. Biol. 1999; 168: 1-8Crossref PubMed Scopus (95) Google Scholar, 10Liu X. Singh B.B. Ambudkar I.S. J. Biol. Chem. 1999; 274: 25121-25129Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (29) Google Scholar), anion exchangers, aquaporins, and ENaCs (11Briel M. Greger R. Kunzelmann K. J. Physiol. (Lond.). 1998; 508: 825-836Crossref Scopus (115) Google Scholar). In salt-absorbing sweat ducts, activation of CFTR causes ENaC stimulation (12Nagel G. Szellas T. Riordan J.R. Friedrich T. Hartung K. EMBO Rep. 2001; 2: 249-254Crossref PubMed Scopus (51) Google Scholar). In other tissues that are absorptive or secretory, depending on the physiological need, activation of CFTR reciprocally inhibits ENaCs (13Schwiebert E.M. Benos D.J. Egan M.E. Stutts M.J. Guggino W.B. Physiol. Rev. 1999; 79: 145-166Crossref PubMed Scopus (379) Google Scholar). Cystic fibrosis, the most prevalent human genetic disease, is caused by CFTR mutations (14Guggino W.B. Stanton B.A. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2006; 7: 426-436Crossref PubMed Scopus (350) Google Scholar). Additionally, the involvement of CFTR in male and female infertility has long been recognized (15Jarzabek K. Zbucka M. Pepinski W. Szamatowicz J. Domitrz J. Janica J. Wolczynski S. Szamatowicz M. Reprod. Biol. 2004; 4: 119-129PubMed Google Scholar). Nearly all men with cystic fibrosis are infertile due to a congenital bilateral absence of the vas deference. Recently, Chan et al. (16Chan H.C. Shi Q.X. Zhou C.X. Wang X.F. Xu W.M. Chen W.Y. Chen A.J. Ni Y. Yuan Y.Y. Mol. Cell. Endocrinol. 2006; 250: 106-113Crossref PubMed Scopus (62) Google Scholar) proposed that HCO3− permeation through CFTR (17Poulsen J.H. Fischer H. Illek B. Machen T.E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 5340-5344Crossref PubMed Scopus (365) Google Scholar) present in endometrial cells plays a role during in vivo sperm capacitation and may account for some cases of female cystic fibrosis infertility. This finding is consistent with the requirement of HCO3− for capacitation. Several modes of regulation of CFTR have been explored, including phosphorylation, Cl- and ATP levels, Em, and direct protein-protein interaction (12Nagel G. Szellas T. Riordan J.R. Friedrich T. Hartung K. EMBO Rep. 2001; 2: 249-254Crossref PubMed Scopus (51) Google Scholar, 18Kunzelmann K. Kiser G.L. Schreiber R. Riordan J.R. FEBS Lett. 1997; 400: 341-344Crossref PubMed Scopus (130) Google Scholar, 19Reddy M.M. Quinton P.M. Am. J. Physiol. 2006; 291 (-C129): C122Crossref Scopus (15) Google Scholar). Interestingly, CFTR and ENaC colocalize and may interact in several tissues (14Guggino W.B. Stanton B.A. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2006; 7: 426-436Crossref PubMed Scopus (350) Google Scholar). In this work, we document the presence of CFTR in both mouse and human sperm and demonstrate that diphenylamine-2-carboxylic acid (DPC), an inhibitor of CFTR, blocks the capacitation-associated hyperpolarization. Moreover, genistein, an activator of CFTR channels, hyperpolarized sperm under conditions that do not support capacitation. These genistein-induced changes in Em were inhibited by DPC. Since CFTR is a Cl- channel, we used the Cl- fluorescent probe N-(ethoxycarbonylmethyl)-6-methoxyquinolinium bromide (MQAE) to determine the intracellular Cl- concentration ([Cl-]i) of noncapacitated mouse sperm and explored the influence of CFTR regulators on this parameter. The addition of genistein, as well as cAMP analogues, promoted Cl- influx in noncapacitated sperm that was blocked by DPC. Considering that closing of ENaCs in sperm is regulated by a cAMP pathway, we hypothesized that CFTR regulation of the sperm Em might be mediated by ENaCs. Consistent with this hypothesis, genistein diminished the amiloride-induced hyperpolarization and the amiloride-sensitive Na+ permeability in noncapacitated sperm that we had reported earlier (8Hernandez-Gonzalez E.O. Sosnik J. Edwards J. Acevedo J.J. Mendoza-Lujambio I. Lopez-Gonzalez I. Demarco I. Wertheimer E. Darszon A. Visconti P.E. J. Biol. Chem. 2006; 281: 5623-5633Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (102) Google Scholar), suggesting that CFTR regulates the capacitation-associated hyperpolarization in mouse sperm through the inhibition of ENaCs. Materials—Amiloride, dibutyryl cyclic AMP (Bt2cAMP), 3-isobutyl-1-methylxantine (IBMX), carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone, valinomycin, nigericin, sodium gluconate, and potassium gluconate were purchased from Sigma. MQAE, 3,3′-dipropylthiadicarbocyanine iodide (DiSC3(5)), 4-acetomido-4′-isothiocyanatostilbene-2,2′-disulfonic acid (SITS) were obtained from Invitrogen. Polyclonal antibody against CFTR was purchased from Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Mouse anti-goat IgG biotin-conjugated and Avidin TRITC-conjugated were from Pierce. DPC was from Sigma. DPC (10 mm stock), genistein, DiSC3(5), carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone, and valinomycin (1 mm stocks) were prepared in Me2SO and stored at -20 °C until use. Bt2cAMP (1 mm), H-89, and IBMX (100 μm) were prepared on the day of the experiment using a modified Krebs-Ringer medium (Whitten's HEPES-buffered (WH) medium) (20Moore G.D. Ayabe T. Visconti P.E. Schultz R.M. Kopf G.S. Development. 1994; 120: 3313-3323Crossref PubMed Google Scholar) and used at the indicated concentration. Sperm Preparation—Experimental protocols were approved by the local Animal Care and Bioethics Committee of the Instituto de Biotecnologiía-Universidad Nacional Autónoma de México. In most experiments, cauda epididymal mouse sperm were collected from CD1 retired male breeders by placing minced cauda epididymis in WH medium. This medium does not support capacitation unless supplemented with 5 mg/ml bovine serum albumin and 24 mm NaHCO3. After 10 min, the sperm suspension was washed in 10 ml of the same medium by centrifugation at 800 × g for 10 min at room temperature. Sperm were then resuspended to a final concentration of 2 × 107 cells/ml and diluted 10 times in the appropriate medium depending on the experiment. To study the role of Cl- in capacitation and in the regulation of Em, NaCl and KCl were replaced by sodium gluconate and potassium gluconate, respectively. Human Sperm Preparation—Semen was obtained from normal, fertile volunteers by masturbation after at least 2 days of abstinence. After liquefaction, 1 ml of Ham's F-10 was applied to 1 ml of semen to allow the motile sperm to swim up into the upper layer of the suspension (1 h at 37 °C). Swim-up sperm were collected and adjusted to 1 × 106 cells/ml. Samples were used for Western blot analysis and indirect immunofluorescence analysis as described for mouse sperm. RNA Isolation and Reverse Transcription-PCR Experiments—Total RNA was prepared from isolated mouse elongated spermatids (21Bellve A.R. Methods Enzymol. 1993; 225: 84-113Crossref PubMed Scopus (300) Google Scholar) or ejaculated human sperm, using TRIzol Reagent (Sigma) according to the manufacturer's instructions. cDNA was synthesized from total RNA samples with random hexamer-primed reverse transcription (Superscript II RNase H-reverse transcriptase; Invitrogen). cDNA was then subjected to PCR amplification using TaqDNA polymerase (Invitrogen). The CFTR subunit primers were designed using the human and mouse reported nucleotide sequence for these genes (human CFTR NM_020038 and mouse CFTR NM_021050, respectively). Primer sequences for human CFTR are as follows: forward, 5′-ATG ATT ATG GGA GAA CTG G-3; reverse, 5′-ATG AGA AAC GGT GTA AGG T-3′. Primer sequences for mouse CFTR are as follows: forward, 5′-GGA GCA AAC CCA AAC A-3′; reverse, 5′-AGC AGC CAC CTC AAC C-3′. The absence of genomic contamination in the RNA samples was confirmed with reverse transcription-negative controls (no reverse transcription) for each experiment. Amplified products were analyzed by DNA sequencing in order to confirm their identity. SDS-PAGE and Immunoblotting—Human and mouse sperm extracts were obtained by the method described by Ref. 22Hernandez-Gonzalez E.O. Lecona-Valera A.N. Escobar-Herrera J. Mujica A. Cell Motil. Cytoskeleton. 2000; 46: 43-58Crossref PubMed Scopus (46) Google Scholar. Sperm were resuspended in sample buffer containing protease inhibitors without 2-mercaptoethanol, and boiled for 5 min. Sperm samples were centrifuged at 10,000 × g for 15 min. After centrifugation, the supernatants were collected, and 2-mercaptoethanol was added to a final concentration of 5% (v/v). The samples were boiled for an additional 5 min and then subjected to 10% SDS-PAGE (23Laemmli U.K. Nature. 1970; 227: 680-685Crossref PubMed Scopus (207537) Google Scholar). Electrotransfer of proteins to Immobilon P (Bio-Rad) and immunodetection of CFTR was carried out as previously described (24Kalab P. Visconti P. Leclerc P. Kopf G.S. J. Biol. Chem. 1994; 269: 3810-3817Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). Immunoblots were incubated with anti-CFTR and developed with the appropriate secondary antibody conjugated to horseradish peroxidase (Sigma) and the chemoluminescent ECL kit (Amersham Biosciences) according to the manufacturer's instructions. Indirect Immunofluorescence—Sperm suspensions were fixed in paraformaldehyde (4% final concentration) for 30 min at room temperature, washed by centrifugation at 800 × g for 5 min, permeabilized in PBS-Triton X-100 (0.05% final concentration) for 15 min at room temperature, and washed three times with PBS. Specific primary antibodies were added to sperm samples and incubated overnight at 4 °C, washed three times with PBS, and then incubated with the appropriate secondary antibody (Biotin-conjugated anti-rabbit IgG) for 1h at 37 °C. The secondary antibody was then subjected to three consecutive washes with PBS and developed by incubation with avidin-fluorescein isothiocyanate diluted in HEPES-saline buffer (20 mm HEPES and 100 mm NaCl, pH 8.2) for 1h at 37 °C. Finally, the samples were washed and mounted in PBS-glycerol (SlowFade, Molecular Probes) and examined using a confocal microscope. Membrane Potential Assay in Sperm Populations—Em was measured as previously described (7Demarco I.A. Espinosa F. Edwards J. Sosnik J. De La Vega-Beltran J.L. Hockensmith J.W. Kopf G.S. Darszon A. Visconti P.E. J. Biol. Chem. 2003; 278: 7001-7009Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (176) Google Scholar). Briefly, sperm were collected as indicated above, diluted in the appropriate medium and capacitated for different time periods depending on the experiment. Eight min before the measurement, 1 μm DiSC3(5) (final concentration) was added to the sperm suspension and further incubated for 5 min at 37 °C. One μm carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone (final concentration) was then added to collapse mitochondrial potential, and sperm were incubated for an additional 2 min. After this period, 1.5 ml of the suspension was transferred to a gently stirred cuvette at 37 °C, and the fluorescence (620/670 nm excitation/emission) was recorded continuously. Calibration was performed as described before by adding 1 μm valinomycin and sequential additions of KCl. Na+-induced Depolarization and Amiloride-induced Hyperpolarization—After reaching steady state fluorescence, 50 mm NaCl was added while fluorescence was recorded in the presence or absence of different compounds as indicated in each figure. After a new fluorescent steady state was reached, calibration was performed as indicated above. Em changes elicited by NaCl were quantified, taking into consideration the calibration curve and the initial steady state fluorescence before NaCl addition. Controls to determine if amiloride or its solvent (Me2SO) altered the fluorescence of DiSC3(5) were performed with dye only and did not show significant changes in fluorescence (data not shown). Intracellular Cl- Measurements in Sperm Populations—[Cl-]i was measured in sperm populations using a Cl--sensitive fluorescent dye (MQAE) (25Verkman A.S. Sellers M.C. Chao A.C. Leung T. Ketcham R. Anal. Biochem. 1989; 178: 355-361Crossref PubMed Scopus (179) Google Scholar). Sperm were incubated with 10 mm MQAE for 30 min at 37 °C. Excess MQAE was removed by diluting sperm 10-fold with WH-Cl--free medium (100 mm sodium gluconate, 4.4 mm potassium gluconate, 1.2 mm KH2PO4, 1.2 mm MgSO4, 5.4 mm glucose, 0.8 mm pyruvic acid, 4.8 mm lactic acid, 20 mm HEPES, pH 7.2) and centrifuging for 3 min at 300 × g. The sperm pellet was resuspended in aliquots of 2 × 106 sperm/ml with medium under the following conditions. 1) To obtain the maximum fluorescence (Fmax), WH-Cl--free medium with nigericin (10 μm) and tributyltin (10 μm) was used. 2) To determine the fluorescence at defined Cl- concentrations (FCl-), two media were mixed (WH containing different NaCl concentrations (10-100 mm) and WH-Cl--free media keeping Cl- + gluconate- = 100 mm); nigericin (10 μm) and tributyltin (10 μm) were also added. 3) For minimum fluorescence (Fmin), 150 mm KSCN buffered with 10 mm HEPES (pH 7.2) and 5 μm valinomycin was used. Samples were illuminated at 350 nm, and emission was collected at 450 nm. The relationship between Cl- concentration and MQAE fluorescence intensity expressed as the ratio F0/FCl- provides a straight line with a slope equal to Kq, the Stern-Volmer constant, where the total quenchable signal F0 is defined by Fmax - Fmin. [Cl-]i was estimated using the constructed plot (25Verkman A.S. Sellers M.C. Chao A.C. Leung T. Ketcham R. Anal. Biochem. 1989; 178: 355-361Crossref PubMed Scopus (179) Google Scholar, 26Inglefield J.R. Schwartz-Bloom R.D. Methods. 1999; 18: 197-203Crossref PubMed Scopus (28) Google Scholar, 27Jayaraman S. Biwersi J. Verkman A.S. Am. J. Physiol. 1999; 276 (-C757): C747Crossref PubMed Google Scholar). The sperm [Cl-]i was also evaluated according to Garcia and Meizel (28Garcia M.A. Meizel S. J. Androl. 1999; 20: 88-93PubMed Google Scholar). Mouse sperm were incubated for 30 min in WH medium containing different Cl- concentrations (0-100 mm) and 10 mm MQAE. Excess MQAE was removed as mentioned above, and emission fluorescence intensity data from sperm suspensions (2 × 106 sperm/ml) were recorded for 120 s. The intracellular and extracellular [Cl-] were equilibrated by permeabilizing the sperm membrane with digitonin (10 μm), and the fluorescence was recorded for another 120 s. The [Cl-]i was calculated as described by Garcia and Meizel (28Garcia M.A. Meizel S. J. Androl. 1999; 20: 88-93PubMed Google Scholar). It is important to note that the values of the [Cl-]i are to be taken cautiously, since they are obtained from a heterogeneous sperm population. Cl- determinations require a calibration, which assumes that the dye behaves in sperm as in other cells (24Kalab P. Visconti P. Leclerc P. Kopf G.S. J. Biol. Chem. 1994; 269: 3810-3817Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 25Verkman A.S. Sellers M.C. Chao A.C. Leung T. Ketcham R. Anal. Biochem. 1989; 178: 355-361Crossref PubMed Scopus (179) Google Scholar, 26Inglefield J.R. Schwartz-Bloom R.D. Methods. 1999; 18: 197-203Crossref PubMed Scopus (28) Google Scholar) and does not correct for residual external dye, and some differences in experimental conditions. It is only possible to wash mouse sperm once by centrifugation, since they loose viability if centrifuged further. The influence of different drugs (i.e. genistein, cAMP/IBMX, DPC, H-89, and SITS) on [Cl-]i was determined using sperm suspensions loaded with MQAE as described above, after recording the basal fluorescence for 1-3 min, and measuring for a further 5-10 min. Two controls were performed: 1) drug solvents (Me2SO or water) were added while the fluorescence was recorded, and 2) MQAE fluorescence without cells was recorded, and the drugs were added. No significant fluorescence changes were observed after performing both controls (data not shown). [Cl-]i changes were estimated as described above. Acrosome Reaction Assay—Caudal epididymal mouse sperm were collected from CD1 mice and placed in capped 1.5-ml microcentrifuge tubes containing medium 199 (Sigma) supplemented with bovine serum albumin (0.4%, w/v), Na+ pyruvate (30 mg/liter), and NaHCO3 (2.2 g/liter) at 37 °C (4-5 × 106 cells/ml). The swim-up method (29Henkel R.R. Schill W.B. Reprod. Biol. Endocrinol. 2003; 1: 108Crossref PubMed Scopus (380) Google Scholar) was used to separate sperm with >90% motility. The sperm suspension was incubated 10 min, and the top ∼1 ml was separated and capacitated for 30 min at 37 °C (30Visconti P.E. Galantino-Homer H. Ning X. Moore G.D. Valenzuela J.P. Jorgez C.J. Alvarez J.G. Kopf G.S. J. Biol. Chem. 1999; 274: 3235-3242Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (271) Google Scholar). AR was induced after capacitation (in the presence or absence of DPC) in a 30-μl aliquot by adding 5 ZP eq/μl or 15 μm A23187. ZP was obtained from mouse oocytes (31Cross N.L. Meizel S. Biol. Reprod. 1989; 41: 635-641Crossref PubMed Scopus (173) Google Scholar). The percentage of AR was determined in a 30-μl aliquot by adding an equal volume of 10% formaldehyde in phosphate-buffered saline. Following fixation, 10-μl aliquots of the sperm suspension were spread onto glass slides and air-dried. The slides were stained with 0.22% Coomassie Blue G-250 in 50% methanol and 10% glacial acetic acid for ∼5 min, rinsed, and mounted with 50% (v/v) glycerol in phosphate-buffered saline (5Munoz-Garay C. De la Vega-Beltran J.L. Delgado R. Labarca P. Felix R. Darszon A. Dev. Biol. 2001; 234: 261-274Crossref PubMed Scopus (83) Google Scholar). At least 100 sperm were assayed per experimental condition to calculate the percentage of AR. Statistical Analysis—The data are expressed as mean ± S.E. The means were compared using an unpaired Student's t test, and p < 0.05 was considered to be statistically significant. CFTR Is Present in Mammalian Sperm—CFTR modulates several cellular processes, interacting with various channels and ionic transporters, particularly with ENaCs (14Guggino W.B. Stanton B.A. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2006; 7: 426-436Crossref PubMed Scopus (350) Google Scholar, 32Sheppard D.N. Welsh M.J. Physiol. Rev. 1999; 79 (-S45): S23Crossref PubMed Scopus (813) Google Scholar). We reported the presence of αENaC and δENaC subunits in mouse sperm (8Hernandez-Gonzalez E.O. Sosnik J. Edwards J. Acevedo J.J. Mendoza-Lujambio I. Lopez-Gonzalez I. Demarco I. Wertheimer E. Darszon A. Visconti P.E. J. Biol. Chem. 2006; 281: 5623-5633Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (102) Google Scholar) and have now found the αENaC subunit in human sperm (data not shown). We examined if CFTR is present in mouse and human sperm. First, the presence of CFTR transcripts was analyzed using reverse transcription-PCR; cDNA was synthesized from total RNA extracted from human sperm ejaculates and purified mouse spermatogenic cells (33Trevino C.L. Felix R. Castellano L.E. Gutierrez C. Rodriguez D. Pacheco J. Lopez-Gonzalez I. Gomora J.C. Tsutsumi V. Hernandez-Cruz A. Fiordelisio T. Scaling A.L. Darszon A. FEBS Lett. 2004; 563: 87-92Crossref PubMed Scopus (66) Google Scholar). Specific primers for CFTR were designed using the reported human and mouse nucleotide sequences for these genes. CFTR fragments of the expected length were detected from human sperm (476 bp) and mouse spermatogenic cells (581 bp) cDNA (Fig. 1A), and their identities were confirmed by DNA sequencing. Because expression of CFTR transcripts in mouse spermatids and in human sperm does not imply the presence of the CFTR protein in mature sperm, Western blot and immunofluorescence experiments were conducted using an anti-CFTR polyclonal antibody. This antibody detected a protein band at the expected molecular weight in both human and mouse sperm, as well as in whole extracts from mouse lung that were included as a positive control (Fig. 1B). In all of these cases, preincubation with the CFTR antigenic peptide eliminated the Western blot signal (Fig. 1B). Using the same antibody, CFTR was immunolocalized to the midpiece of human (Fig. 1C) and mouse sperm (Fig. 1E). It is worth noting that αENaC localized to the same sperm region (8Hernandez-Gonzalez E.O. Sosnik J. Edwards J. Acevedo J.J. Mendoza-Lujambio I. Lopez-Gonzalez I. Demarco I. Wertheimer E. Darszon A. Visconti P.E. J. Biol. Chem. 2006; 281: 5623-5633Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (102) Google Scholar). Previous incubation of the antibody with the respective antigenic peptide blocked the immunofluorescence signal (Fig. 1, D and F). CFTR Is Involved in the Capacitation-associated Hyperpolarization—Since CFTR is a Cl- channel, it may contribute to the mouse sperm resting Em and to the changes it undergoes during capacitation. Interestingly, 250 μm DPC, which inhibits CFTR, was able to block the capacitation-associated hyperpolarization without affecting the Em of sperm incubated under conditions that do not support capacitation (Fig. 2). On the other hand, noncapacitated sperm incubated 10 min with 10 μm genistein, a compound that activates CFTR, undergo a hyperpolarization that was greater than that which accompanies capacitation. Notably, the genistein-induced hyperpolarization was blocked by DPC. These results indicate that CFTR activation influences the sperm Em (Fig. 2, A and B). CFTR Participates in Capacitation—Taking into consideration that DPC blocked the capacitation-associated hyperpolarization, we explored whether CFTR inhibition was also able to block the capacitation process. Two experimental protocols were used. 1) Mouse sperm were capacitated in the presence or absence of 250 μm DPC, and then the AR was induced adding ZP. 2) Sperm were capacitated in the absence of DPC and then incubated for 5 min with DPC, just prior to the induction o

تكتسب الحيوانات المنوية في الثدييات القدرة على الإخصاب في القناة الأنثوية خلال عملية تعرف باسم السعة. في الحيوانات المنوية للفئران، ترتبط هذه العملية بزيادات في فسفرة التيروزين البروتيني، وفرط الاستقطاب المحتمل للغشاء، وزيادة في الأس الهيدروجيني داخل الخلايا و Ca2+، والحركة مفرطة النشاط. الآليات الجزيئية المشاركة في هذه التغييرات غير معروفة تمامًا. تشير الأدلة الحالية إلى أنه في الحيوانات المنوية للفأر، يتم تنظيم فرط الاستقطاب الغشائي المرتبط بالسعة من خلال مسار يعتمد على cAMP/البروتين كيناز A يتضمن تنشيط قنوات K+ المصححة للداخل وتثبيط قنوات الصوديوم الظهارية (ENaCs). منظم توصيل التليف الكيسي عبر الغشاء (CFTR) هو قناة Cl التي تتحكم في نشاط العديد من بروتينات النقل، بما في ذلك ENaCs. هنا استكشفنا ما إذا كان CFTR يشارك في تنظيم تثبيط ENaC في الحيوانات المنوية، وبالتالي فهو ضروري لفرط الاستقطاب المرتبط بالسعة. باستخدام النسخ العكسي - PCR واللطخة الغربية والكيمياء المناعية، نقوم بتوثيق وجود CFTR في الفأر والحيوانات المنوية البشرية. ومن المثير للاهتمام، أن إضافة مثبط CFTR (حمض ثنائي فينيل أمين-2 - كربوكسيلي ؛ 250 ميكرومتر) منع فرط الاستقطاب المرتبط بالسعة، ومنع إغلاق ENaC، وقلل من تفاعل الجسيم الطرفي الناجم عن المنطقة الشفافة دون التأثير على الزيادة في فسفرة التيروزين. كما أدى حضانة الحيوانات المنوية في وسط خالٍ من الكلور إلى القضاء على فرط الاستقطاب المرتبط بالسعة. من ناحية أخرى، عزز منشط CFTR (جينيستين ؛ 5-10 ميكرومتر) فرط الاستقطاب في الحيوانات المنوية للفأر المحتضنة في ظل ظروف لا تدعم السعة. إضافة ديبوتيريل أمبير حلقي إلى الحيوانات المنوية غير المكثفة للفأر مرتفعة داخل الخلايا Cl -. تشير هذه النتائج إلى أن التدفقات المعتمدة على المخيم من خلال CFTR تشارك في تنظيم ENaC أثناء السعة وبالتالي تساهم في فرط الاستقطاب الملحوظ المرتبط بهذه العملية. تكتسب الحيوانات المنوية في الثدييات القدرة على الإخصاب في القناة الأنثوية خلال عملية تعرف باسم السعة. في الحيوانات المنوية للفئران، ترتبط هذه العملية بزيادات في فسفرة التيروزين البروتيني، وفرط الاستقطاب المحتمل للغشاء، وزيادة في الأس الهيدروجيني داخل الخلايا و Ca2+، والحركة مفرطة النشاط. الآليات الجزيئية المشاركة في هذه التغييرات غير معروفة تمامًا. تشير الأدلة الحالية إلى أنه في الحيوانات المنوية للفأر، يتم تنظيم فرط الاستقطاب الغشائي المرتبط بالسعة من خلال مسار يعتمد على cAMP/البروتين كيناز A يتضمن تنشيط قنوات K+ المصححة للداخل وتثبيط قنوات الصوديوم الظهارية (ENaCs). منظم موصلية التليف الكيسي عبر الغشاء (CFTR) هو قناة Cl التي تتحكم في نشاط العديد من بروتينات النقل، بما في ذلك ENaCs. هنا استكشفنا ما إذا كان CFTR يشارك في تنظيم تثبيط ENaC في الحيوانات المنوية، وبالتالي فهو ضروري لفرط الاستقطاب المرتبط بالسعة. باستخدام النسخ العكسي - PCR واللطخة الغربية والكيمياء المناعية، نقوم بتوثيق وجود CFTR في الفأر والحيوانات المنوية البشرية. ومن المثير للاهتمام، أن إضافة مثبط CFTR (حمض ثنائي فينيل أمين-2 - كربوكسيلي ؛ 250 ميكرومتر) منع فرط الاستقطاب المرتبط بالسعة، ومنع إغلاق ENaC، وقلل من تفاعل الجسيم الطرفي الناجم عن المنطقة الشفافة دون التأثير على الزيادة في فسفرة التيروزين. كما أدى حضانة الحيوانات المنوية في وسط خالٍ من الكلور إلى القضاء على فرط الاستقطاب المرتبط بالسعة. من ناحية أخرى، عزز منشط CFTR (جينيستين ؛ 5-10 ميكرومتر) فرط الاستقطاب في الحيوانات المنوية للفأر المحتضنة في ظل ظروف لا تدعم السعة. إضافة ديبوتيريل أمبير حلقي إلى الحيوانات المنوية غير المكثفة للفأر مرتفعة داخل الخلايا Cl -. تشير هذه النتائج إلى أن التدفقات المعتمدة على المخيم من خلال CFTR تشارك في تنظيم ENaC أثناء السعة وبالتالي تساهم في فرط الاستقطاب الملحوظ المرتبط بهذه العملية. تكثيف الحيوانات المنوية هو ظاهرة معقدة مطلوبة للإخصاب. في الحيوانات المنوية للفأر، تشمل السعة إعادة تنظيم غشاء البلازما، وزيادة فسفرة البروتين التيروزين، وفرط الاستقطاب في إمكانات غشاء البلازما (Em)، 2 الاختصارات المستخدمة هي: Em، إمكانات غشاء البلازما ؛ AR، تفاعل الأكروسوم ؛ ZP، zona pellucida ؛ ENaC، قناة الصوديوم الظهارية ؛ PKA، بروتين كيناز A ؛ CFTR، منظم توصيل التليف الكيسي عبر الغشاء ؛ Bt2cAMP، dibutyryl cyclic AMP ؛ IBMX، 3 - isobutyl -1 - methylxantine ؛ MQAE، N -(ethoxycarbonylmethyl) -6 - methoxyquinolinolinium bromide ؛ DiSC3 (5)، 3،3′ - dipropylthiadicarbocyanine iodide ؛ 4 - acetomido -4 ′ - isisothiocyanbyl - 2،2 ′ ulfdonic acid ؛ TRITC، T - tramethylmethylmethylmethyl isothianate ؛ Dipoxyquinolinium acid ؛ Dipxy - 2 - clamenine ؛ HSC3 (5)، 3،3،3،3،3 ′ - dipropyltiadicarbocyanine ipocyanine iodinine iod (1،2) (1،2،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،5،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،4،2،4،4،4،4،4،4،4،4،4 1 Darszon A. Nishigaki T. Wood C. Trevino C.L. Felix R. Beltran C. Int. Rev. Cytol. 2005; 243: 79-172 Crossref PubMed Scopus (139) Google Scholar and 2Visconti P.E. Westbrook V.A. Chertihin O. Demarco I. Sleight S. Diekman A.B.J. Reprod. Immunol. 2002 ؛ 53: 133-150 Crossref PubMed Scopus (290) الباحث العلمي من Google). يرتبط السعة أيضًا بظهور الحركة مفرطة النشاط (3Yanagimachi R. Knobile E. Neill J.D. فسيولوجيا التكاثر. 1. 1994: 189-317 الباحث العلمي من Google). كل هذه التغييرات الحيوانات المنوية الرئيسية للوصول بشكل فعال واختراق الطبقات الخارجية من البويضة والخضوع لتفاعل الجسيم الطرفي (AR) (4Florman H.M. Arnoult C. Kazam IG Li C. O'Toole C.M. Biol. Reprod. 1998; 59: 12-16 Crossref PubMed Scopus (166) Google Scholar). من بين التغييرات التي لوحظت أثناء تكثيف الحيوانات المنوية للفأر، تم اقتراح الاستقطاب المفرط الذي يحدث أثناء هذه العملية للعب دور مهم في إزالة التعطيل من قنوات Ca2 + المعتمدة على الجهد بحيث تفتح على إزالة الاستقطاب الناجم عن المنطقة الشفافة (ZP) وتؤدي إلى AR. لا يُعرف سوى القليل عن الكيانات الجزيئية التي تشارك في هذا الاستقطاب المفرط وكيف يتم الجمع بين جميع التغييرات المرتبطة بالسعة لتعزيز السعة. تم اقتراح العديد من المرشحين للمشاركة في الاستقطاب المفرط الناجم عن السعة. أظهرت الدراسات من مجموعتنا أن تصحيح قنوات K+ داخليًا يساهم في هذا الاستقطاب المفرط (5Munoz - Garay C. De la Vega - Beltran J.L. Delgado R. Labarca P. Felix R. Darszon A. Dev. Biol. 2001; 234: 261-274 Crossref PubMed Scopus (83) Google Scholar, 6Acevedo J.J. Mendoza - Lujambio I. de la Vega - Beltran J.L. Trevino C.L. Felix R. Darszon A. Dev. بيول. 2006 ؛ 289: 395-405 كروسريف بوبميد سكوبس (45) الباحث العلمي من جوجل). بالإضافة إلى ذلك، قمنا بتوثيق أن الناقل الكهربائي Na+/ HCO3 - يزيد من استقطاب الحيوانات المنوية للفأر عندما يكون HCO3 - الخارجي مرتفعًا (7Demarco I.A. Espinosa F. Edwards J. Sosnik J. De La Vega - Beltran J.L. Hockensmith J.W. Kopf G.S. Darszon A. Visconti P.E.J Biol. كيم. 2003 ؛ 278: 7001-7009 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (176) الباحث العلمي من Google). علاوة على ذلك، أبلغنا مؤخرًا عن وجود قنوات Na+ الظهارية (ENaCs) في الحيوانات المنوية للفأر وأظهرنا أن انخفاض نفاذية Na+ للحيوانات المنوية ضروري لفرط الاستقطاب المرتبط بالسعة (8 هيرنانديز- غونزاليز E.O. Sosnik J. Edwards J. Acevedo JJ Mendoza - Lujambio I. Lopez - Gonzalez I. Demarco I. Wertheimer E. Darszon A. Visconti P.E.J. Biol. Chem. 2006; 281: 5623-5633 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (102) Google Scholar). يشير هذا العمل اللاحق بقوة إلى أن الحيوانات المنوية للفأر (ENaCs) تنشط بشكل أساسي في الحيوانات المنوية غير المجهزة وتغلق أثناء السعة، مما يؤدي إلى فرط الاستقطاب. ومن المثير للاهتمام أن التجارب في هذا العمل تشير إلى أن إغلاق ENaCs يتم تنظيمه بشكل مباشر أو غير مباشر من خلال مسار يعتمد على cAMP/protein kinase A (PKA) (8 Hernandez - Gonzalez E.O. Sosnik J. Edwards J. Acevedo J.J. Mendoza - Lujambio I. Lopez - Gonzalez I. Demarco I. Wertheimer E. Darszon A. Visconti P.E.J Biol. Chem. 2006; 281: 5623-5633 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (102) Google Scholar). منظم توصيل التليف الكيسي عبر الغشاء (CFTR) هو عبارة عن قناة Cl معدلة بمخيم ومنظم للعديد من الناقلات والبروتينات، بما في ذلك قنوات K+، مثل ROMK1 و ROMK2 (9Kunzelmann K. Schreiber RJ Membr. Biol. 1999; 168: 1-8 Crossref PubMed Scopus (95) Google Scholar, 10Liu X. Singh B.B. Ambudkar I.S.J. Biol. Chem. 1999; 274: 25121-25129 Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (29) Google Scholar), anion exchangeangers, aquaporins, and ENaCs (11Briel M. Greger R. Kunzelmann K. J. Physiol. (لوند.). 1998 ؛ 508: 825-836 Crossref Scopus (115) الباحث العلمي من Google). في قنوات العرق الممتصة للملح، يؤدي تنشيط CFTR إلى تحفيز ENaC (12Nagel G. Szellas T. Riordan JR Friedrich T. Hartung K. EMBO Rep. 2001; 2: 249-254 Crossref PubMed Scopus (51) Google Scholar). في الأنسجة الأخرى التي تكون امتصاصية أو إفرازية، اعتمادًا على الحاجة الفسيولوجية، يمنع تنشيط CFTR بشكل متبادل ENaCs (13Schwiebert E.M. Benos D.J. Egan M.E. Stutts M.J. Guggino WB Physiol. مراجعة. 1999 ؛ 79: 145-166 Crossref PubMed Scopus (379) الباحث العلمي من Google). يحدث التليف الكيسي، وهو المرض الوراثي البشري الأكثر انتشارًا، بسبب طفرات CFTR (14Guggino WB Stanton B.A. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2006 ؛ 7: 426-436 Crossref PubMed Scopus (350) الباحث العلمي من Google). بالإضافة إلى ذلك، تم الاعتراف منذ فترة طويلة بمشاركة CFTR في العقم عند الذكور والإناث (15Jarzabek K. Zbucka M. Pepinski W. Szamatowicz J. Domitrz J. Janica J. Wolczynski S. Szamatowicz M. Reprod. بيول. 2004 ؛ 4: 119-129 بوب ميد الباحث العلمي من جوجل). يعاني جميع الرجال المصابين بالتليف الكيسي تقريبًا من العقم بسبب الغياب الخلقي الثنائي للإذعان الوعائي. في الآونة الأخيرة، تشان وآخرون. (16Chan H.C. Shi Q.X. Zhou C.X. Wang X.F. Xu W.M. Chen W.Y. Chen A.J. Ni Y. Yuan Y.Y. Mol. خلية. الغدد الصماء. 2006 ؛ 250: 106-113 اقترح Crossref PubMed Scopus (62) Google Scholar) أن HCO3 - يتخلل من خلال CFTR (17Poulsen J.H. Fischer H. Illek B. Machen T.E. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1994; 91: 5340-5344 Crossref PubMed Scopus (365) Google Scholar) الموجود في خلايا بطانة الرحم يلعب دورًا أثناء تكثف الحيوانات المنوية في الجسم الحي وقد يفسر بعض حالات العقم الناجم عن التليف الكيسي الأنثوي. تتوافق هذه النتيجة مع متطلبات HCO3- للتكثيف. تم استكشاف العديد من طرق تنظيم CFTR، بما في ذلك الفسفرة، ومستويات Cl - و ATP، و Em، والتفاعل المباشر للبروتين والبروتين (12Nagel G. Szellas T. Riordan JR Friedrich T. Hartung K. EMBO Rep. 2001 ؛ 2: 249-254 Crossref PubMed Scopus (51) Google Scholar، 18Kunzelmann K. Kiser GL Schreiber R. Riordan JR FEBS Lett. 1997 ؛ 400: 341-344 Crossref PubMed Scopus (130) Google Scholar، 19Reddy M.M. Quinton PM. J. Physiol. 2006 ؛ 291 (- C129): C122Crossref Scopus (15) الباحث العلمي من Google). ومن المثير للاهتمام أن CFTR وENaC يتجمعان وقد يتفاعلان في عدة أنسجة (14Guggino WB Stanton B.A. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2006 ؛ 7: 426-436 Crossref PubMed Scopus (350) الباحث العلمي من Google). في هذا العمل، نوثق وجود CFTR في كل من الفأر والحيوانات المنوية البشرية ونثبت أن حمض ثنائي فينيل أمين-2 - كربوكسيلي (DPC)، وهو مثبط لـ CFTR، يمنع الاستقطاب المفرط المرتبط بالسعة. علاوة على ذلك، فإن الجينيستين، وهو منشط لقنوات CFTR، والحيوانات المنوية شديدة الاستقطاب في ظل ظروف لا تدعم السعة. تم تثبيط هذه التغييرات التي يسببها الجينيستين في Em بواسطة DPC. نظرًا لأن CFTR عبارة عن قناة Cl -، فقد استخدمنا مسبار Cl - fluorescent N -(ethoxycarbonylmethyl) -6 - methoxyquinolinium bromide (MQAE) لتحديد تركيز Cl - داخل الخلايا ([Cl -]i) من الحيوانات المنوية للفأر غير المكثفة واستكشفنا تأثير منظمات CFTR على هذه المعلمة. عززت إضافة الجينيستين، بالإضافة إلى نظائر المخيم، تدفق الكلوريد في الحيوانات المنوية غير المؤهلة التي تم حظرها بواسطة DPC. بالنظر إلى أن إغلاق ENaCs في الحيوانات المنوية يتم تنظيمه من خلال مسار المخيم، فقد افترضنا أن تنظيم CFTR للحيوانات المنوية قد يكون بوساطة ENaCs. تماشياً مع هذه الفرضية، قلل الجينيستين من فرط الاستقطاب الناجم عن الأميلوريد ونفاذية Na+ الحساسة للأميلوريد في الحيوانات المنوية غير المتكيفة التي أبلغنا عنها سابقًا (8 هيرنانديز- غونزاليز E.O. Sosnik J. Acevedo J. J. Mendoza - Lujambio I. Lopez - Gonzalez I. Demarco I. Wertheimer E. Darszon A. Visconti P.E. J. Biol. Chem. 2006; 281: 5623-5633 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (102) Google Scholar)، مما يشير إلى أن CFTR ينظم فرط الاستقطاب المرتبط بالسعة في الحيوانات المنوية للفأر من خلال تثبيط ENaCs. المواد - تم شراء Amiloride و dibutyryl cyclic AMP (Bt2cAMP) و 3 - isobutyl -1 - methylxantine (IBMX) و carbonyl cyanide m - chlorophenylhydrazone و valinomycin و nigericin و sodium gluconate و potassium gluconate من Sigma. تم الحصول على MQAE، 3،3'- ثنائي بروبيل ثياديكاربوسيانين يوديد (DiSC3 (5))، 4 - acetomido -4 '- isothiocyanatostilbene -2،2 '- disulfonic acid (SITS) من Invitrogen. تم شراء الجسم المضاد متعدد النسائل ضد CFTR من شركة سانتا كروز للتكنولوجيا الحيوية (سانتا كروز، كاليفورنيا). كان الماوس المضاد للماعز IgG المقترن بالبيوتين و Avidin TRITC المقترن من Pierce. كان DPC من Sigma. تم تحضير DPC (مخزون 10 مم)، و genistein، و DiSC3 (5)، و carbonyl cyanide m - chlorophenylhydrazone، و valinomycin (مخزون 1 مم) في Me2SO وتخزينها عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. تم تحضير Bt2cAMP (1 مم) و H -89 و IBMX (100 ميكرومتر) في يوم التجربة باستخدام وسيط Krebs - Ringer معدل (وسط Whitten 's HEPES - buffered (WH)) (20Moore G.D. Ayabe T. Visconti P.E. Schultz R.M. Kopf G.S. Development. 1994 ؛ 120: 3313-3323 Crossref PubMed Google Scholar) وتستخدم بالتركيز المشار إليه. تمت الموافقة على بروتوكولات تحضير الحيوانات المنوية التجريبية من قبل اللجنة المحلية لرعاية الحيوان وأخلاقيات علم الأحياء التابعة لمعهد التكنولوجيا الحيوية - الجامعة الوطنية المستقلة في المكسيك. في معظم التجارب، تم جمع الحيوانات المنوية لفأر ذيل البربخ من مربي ذكور متقاعدين من CD1 عن طريق وضع ذيل البربخ المفروم في وسط WH. لا يدعم هذا الوسيط التكثيف ما لم يتم استكماله بألبومين مصل الأبقار 5 مجم/مل و 24 مم من NaHCO3. بعد 10 دقائق، تم غسل معلق الحيوانات المنوية في 10 مل من نفس الوسط عن طريق الطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم أعيد تعليق الحيوانات المنوية إلى تركيز نهائي قدره 2 × 107 خلية/مل وتم تخفيفها 10 مرات في الوسط المناسب اعتمادًا على التجربة. لدراسة دور Cl - في السعة وفي تنظيم Em، تم استبدال NaCl و KCl بغلوكونات الصوديوم وغلوكونات البوتاسيوم، على التوالي. تحضير الحيوانات المنوية البشرية - تم الحصول على السائل المنوي من المتطوعين الطبيعيين الخصبة عن طريق الاستمناء بعد يومين على الأقل من الامتناع عن ممارسة الجنس. بعد التسييل، تم وضع 1 مل من لحم الخنزير F -10 على 1 مل من السائل المنوي للسماح للحيوانات المنوية المتحركة بالسباحة في الطبقة العليا من المعلق (ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية). تم جمع الحيوانات المنوية للسباحة وتعديلها إلى 1 × 106 خلية/مل. تم استخدام عينات لتحليل اللطخة الغربية وتحليل التألق المناعي غير المباشر كما هو موضح للحيوانات المنوية للفأر. تجارب عزل الحمض النووي الريبوزي والنسخ العكسي - تفاعل البوليميراز المتسلسل - تم تحضير إجمالي الحمض النووي الريبوزي من الحيوانات المنوية الممدودة للفئران المعزولة (21Bellve A.R. Methods Enzymol. 1993 ؛ 225: 84-113 Crossref PubMed Scopus (300) Google Scholar) أو الحيوانات المنوية البشرية المقذوفة، باستخدام كاشف TRIzol (Sigma) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم تصنيع cDNA من عينات RNA الإجمالية مع نسخ عكسي عشوائي بسداسي (Superscript II RNase H - reverse transcriptase ؛ Invitrogen). ثم تعرض cDNA لتضخيم PCR باستخدام بوليميراز TaqDNA (Invitrogen). تم تصميم بادئات الوحدة الفرعية CFTR باستخدام تسلسل النيوكليوتيدات الذي تم الإبلاغ عنه من قبل الإنسان والفأر لهذه الجينات (CFTR NM _020038 البشري و CFTR NM _021050 الفأر، على التوالي). التسلسلات التمهيدية لـ CFTR البشري هي كما يلي: إلى الأمام، 5'- ATG ATT ATG GGA GAA CTG G -3 ؛ عكس، 5'- ATG AGA AAC GGT GTA AGG T -3'. تسلسلات التمهيدي للماوس CFTR هي كما يلي: إلى الأمام، 5'-GGA GCA AAC CCA A -3'؛ عكسي، 5'- AGC AGC CAC CTC AAC C -3'. تم تأكيد عدم وجود تلوث جيني في عينات الحمض النووي الريبي مع ضوابط سلبية للنسخ العكسي (لا يوجد نسخ عكسي) لكل تجربة. تم تحليل المنتجات المضخمة من خلال تسلسل الحمض النووي من أجل تأكيد هويتها. SDS - PAGE و Immunoblotting - تم الحصول على مستخلصات الحيوانات المنوية البشرية والفأرية بالطريقة الموصوفة في المرجع. 22 هيرنانديز غونزاليز E.O. Lecona - Valera A.N. Escobar - Herrera J. Mujica A. Cell Motil. الهيكل الخلوي. 2000 ؛ 46: 43-58 Crossref PubMed Scopus (46) الباحث العلمي من Google. تم إعادة تعليق الحيوانات المنوية في عينة عازلة تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني بدون 2 - ميركابتو إيثانول، وتم غليها لمدة 5 دقائق. تم طرد عينات الحيوانات المنوية مركزيًا عند 10000 × جم لمدة 15 دقيقة. بعد الطرد المركزي، تم جمع المواد الطافية، وأضيف 2 - ميركابتو إيثانول إلى تركيز نهائي قدره 5 ٪ (حجم/حجم). تم غلي العينات لمدة 5 دقائق إضافية ثم أخضعت لـ 10 ٪ SDS - PAGE (23Laemmli U.K. Nature. 1970 ؛ 227: 680-685 Crossref PubMed Scopus (207537) الباحث العلمي من Google). تم إجراء النقل الكهربائي للبروتينات إلى Immobilon P (Bio - Rad) والكشف المناعي لـ CFTR كما هو موضح سابقًا (24Kalab P. Visconti P. Leclerc P. Kopf G.S.J Biol. Chem. 1994; 269: 3810-3817 Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar). تم تحضين اللطخات المناعية بمضاد CFTR وتطويرها مع الجسم المضاد الثانوي المناسب المقترن ببيروكسيديز الفجل (Sigma) ومجموعة ECL الكيميائية (Amersham Biosciences) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم تثبيت معلقات الفلورة المناعية غير المباشرة للحيوانات المنوية في بارافورمالدهيد (تركيز نهائي 4 ٪) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وغسلها بالطرد المركزي عند 800 × جم لمدة 5 دقائق، ونفاذية في PBS - Triton X -100 (تركيز نهائي 0.05 ٪) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS. تمت إضافة أجسام مضادة أولية محددة إلى عينات الحيوانات المنوية واحتضانها بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية، وغسلها ثلاث مرات باستخدام PBS، ثم احتضانها بالجسم المضاد الثانوي المناسب (IgG المضاد للأرانب المقترن بالبيوتين) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. تم بعد ذلك إخضاع الجسم المضاد الثانوي لثلاث عمليات غسل متتالية باستخدام PBS وتم تطويره عن طريق الحضانة باستخدام إيزوثيوسيانات أفيدين فلوريسين المخفف في محلول ملحي HEPES (20 مم HEPES و 100 مم NaCl، pH 8.2) لمدة ساعة واحدة عند 37 درجة مئوية. أخيرًا، تم غسل العينات وتركيبها في PBS - glycerol (SlowFade، Molecular Probes) وفحصها باستخدام مجهر متحد البؤر. تم قياس الفحص المحتمل للغشاء في مجموعات الحيوانات المنوية كما هو موضح سابقًا (7Demarco I.A. Espinosa F. Edwards J. Sosnik J. De La Vega - Beltran J.L. Hockensmith J.W. Kopf G.S. Darszon A. Visconti P.E.J. Biol. كيم. 2003 ؛ 278: 7001-7009 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (176) الباحث العلمي من Google). باختصار، تم جمع الحيوانات المنوية كما هو موضح أعلاه، وتم تخفيفها في الوسط المناسب وتكثيفها لفترات زمنية مختلفة اعتمادًا على التجربة. قبل ثماني دقائق من القياس، تمت إضافة 1 ميكرومتر DiSC3 (5) (التركيز النهائي) إلى معلق الحيوانات المنوية وتم تحضينه لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. ثم تمت إضافة واحد ميكرومتر من سيانيد الكربونيل m - chlorophenylhydrazone (التركيز النهائي) لانهيار إمكانات الميتوكوندريا، وتم حضانة الحيوانات المنوية لمدة دقيقتين إضافيتين. بعد هذه الفترة، تم نقل 1.5 مل من المعلق إلى كوفيت مقلوب بلطف عند 37 درجة مئوية، وتم تسجيل الفلورة (620/670 نانومتر إثارة/انبعاث) بشكل مستمر. تم إجراء المعايرة كما هو موضح من قبل بإضافة 1 ميكرومتر من فالينومايسين والإضافات المتسلسلة من KCl. إزالة الاستقطاب المستحث بـ Na+ وفرط الاستقطاب المستحث بـ Amiloride - بعد الوصول إلى فلورة الحالة الثابتة، تمت إضافة 50 مم من كلوريد الصوديوم بينما تم تسجيل الفلورة في وجود أو عدم وجود مركبات مختلفة كما هو موضح في كل شكل. بعد الوصول إلى حالة ثابتة جديدة من الفلورسنت، تم إجراء المعايرة كما هو موضح أعلاه. تم قياس التغيرات التي أحدثها كلوريد الصوديوم، مع الأخذ في الاعتبار منحنى المعايرة والفلورة الأولية في الحالة الثابتة قبل إضافة كلوريد الصوديوم. تم إجراء الضوابط لتحديد ما إذا كان الأميلوريد أو مذيبه (Me2SO) قد غير فلورة DiSC3 (5) باستخدام الصبغة فقط ولم تظهر تغييرات كبيرة في الفلورة (البيانات غير موضحة). قياسات Cl - داخل الخلايا في مجموعات الحيوانات المنوية - تم قياس [Cl -]i في مجموعات الحيوانات المنوية باستخدام صبغة الفلورسنت الحساسة لـ Cl (MQAE) (25Verkman A.S. Sellers M.C. Chao A.C. Leung T. Ketcham R. Anal. Biochem. 1989; 178: 355-361 Crossref PubMed Scopus (179) Google Scholar). تم حضانة الحيوانات المنوية بـ 10 مم MQAE لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية. تمت إزالة MQAE الزائد عن طريق تخفيف الحيوانات المنوية 10 أضعاف باستخدام وسط خالٍ من WH - Cl (100 مم غلوكونات الصوديوم، 4.4 مم غلوكونات البوتاسيوم، 1.2 مم KH2PO4، 1.2 مم MgSO4، 5.4 مم جلوكوز، 0.8 مم حمض البيروفيك، 4.8 مم حمض اللبنيك، 20 مم HEPES، الرقم الهيدروجيني 7.2) والطرد المركزي لمدة 3 دقائق عند 300 × جم. تم إعادة تعليق حبيبات الحيوانات المنوية في سوائل من 2 × 106 من الحيوانات المنوية/مل مع وسط في ظل الظروف التالية. 1) للحصول على أقصى قدر من التألق (Fmax)، تم استخدام وسط خالٍ من WH - Cl مع نيجريسين (10 ميكرومتر) وثلاثي البوتيلتين (10 ميكرومتر). 2) لتحديد الفلورة عند تركيزات Cl محددة (FCl -)، تم خلط وسطين (WH تحتوي على تركيزات NaCl مختلفة (10-100 مم) ووسائط خالية من WH - Cl تحافظ على Cl - + gluconate - = 100 مم) ؛ كما تمت إضافة النيجيريسين (10 ميكرومتر) وثلاثي البوتيلتين (10 ميكرومتر). 3) للحصول على الحد الأدنى من الفلورة (Fmin)، تم استخدام 150 مم KSCN مخزنة مع 10 مم HEPES (الرقم الهيدروجيني 7.2) و 5 ميكرومتر فالينومايسين. تم إضاءة العينات عند 350 نانومتر، وتم جمع الانبعاثات عند 450 نانومتر. توفر العلاقة بين تركيز Cl وشدة الفلورة MQAE المعبر عنها في صورة النسبة F0/FCl - خطًا مستقيمًا بميل يساوي Kq، ثابت Stern - Volmer، حيث يتم تحديد إجمالي الإشارة القابلة للإخماد F0 بواسطة Fmax - Fmin. [Cl -] تم تقديري باستخدام قطعة الأرض المبنية (25Verkman A.S. Sellers M.C. Chao A.C. Leung T. Ketcham R. Anal. Biochem. 1989; 178: 355-361 Crossref PubMed Scopus (179) Google Scholar, 26Inglefield J.R. Schwartz - Bloom R.D. Methods. 1999 ؛ 18: 197-203 Crossref PubMed Scopus (28) Google Scholar، 27Jayaraman S. Biwersi J. Verkman A.S. Am. J. Physiol. 1999 ؛ 276 (- C757): C747Crossref PubMed Google Scholar). تم تقييم الحيوانات المنوية [Cl -]i أيضًا وفقًا لغارسيا ومايزيل (28Garcia M.A. Meizel SJ Androl. 1999 ؛ 20: 88-93 PubMed الباحث العلمي من Google). تم حضانة الحيوانات المنوية للفأر لمدة 30 دقيقة في وسط WH يحتوي على تركيزات Cl مختلفة (0-100 مم) و 10 مم MQAE. تمت إزالة MQAE الزائد كما هو مذكور أعلاه، وتم تسجيل بيانات شدة الفلورة الانبعاثية من معلق الحيوانات المنوية (2 × 106 حيوان منوي/مل) لمدة 120 ثانية. تمت موازنة [Cl -] داخل الخلايا وخارجها عن طريق نفاذية غشاء الحيوانات المنوية باستخدام الديجيتونين (10 ميكرومتر)، وتم تسجيل التألق لمدة 120 ثانية أخرى. تم حساب [Cl -]i كما وصفه Garcia و Meizel (28Garcia M.A. Meizel SJ Androl. 1999 ؛ 20: 88-93 PubMed الباحث العلمي من Google). من المهم ملاحظة أن قيم [Cl -]i يجب أن تؤخذ بحذر، حيث يتم الحصول عليها من مجموعة من الحيوانات المنوية غير المتجانسة. تتطلب تحديدات Cl - معايرة، والتي تفترض أن الصبغة تتصرف في الحيوانات المنوية كما هو الحال في الخلايا الأخرى (24Kalab P. Visconti P. Leclerc P. Kopf G.S.J. Biol. Chem. 1994; 269: 3810-3817 Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 25Verkman A.S. Sellers M.C. Chao A.C. Leung T. Ketcham R. Anal. Biochem. 1989; 178: 355-361 Crossref PubMed Scopus (179) Google Scholar, 26Inglefield J.R. Schwartz - Bloom R.D. Methods. 1999 ؛ 18: 197-203 Crossref PubMed Scopus (28) Google Scholar) ولا يصحح الصبغة الخارجية المتبقية، وبعض الاختلافات في الظروف التجريبية. لا يمكن غسل الحيوانات المنوية للفأر إلا مرة واحدة عن طريق الطرد المركزي، لأنها تفقد صلاحيتها إذا تم طردها مركزيًا بشكل أكبر. تم تحديد تأثير الأدوية المختلفة (أي الجينيستين، cAMP/IBMX، DPC، H -89، و SITS) على [Cl -]i باستخدام معلقات الحيوانات المنوية المحملة بـ MQAE كما هو موضح أعلاه، بعد تسجيل الفلورة القاعدية لمدة 1-3 دقائق، والقياس لمدة 5-10 دقائق أخرى. تم إجراء عنصرين من عناصر التحكم: 1) تمت إضافة مذيبات دوائية (Me2SO أو ماء) أثناء تسجيل الفلورة، و 2) تم تسجيل فلورة MQAE بدون خلايا، وتمت إضافة الأدوية. لم يلاحظ أي تغييرات كبيرة في الفلورة بعد إجراء كلا الضابطين (لم يتم عرض البيانات). تم تقدير التغييرات كما هو موضح أعلاه. فحص تفاعل الأكروسوم - تم جمع الحيوانات المنوية للفأر البربخي الذيلي من فئران CD1 ووضعها في أنابيب طرد مركزي دقيقة 1.5 مل تحتوي على وسط 199 (سيجما) مكمل بألبومين مصل البقر (0.4 ٪، وزن/حجم)، Na+ بيروفات (30 مجم/لتر)، و NaHCO3 (2.2 جم/لتر) عند 37 درجة مئوية (4-5 × 106 خلية/مل). طريقة السباحة (29Henkel RR Schill WB Reprod. بيول. الغدد الصماء. 2003 ؛ 1: 108 تم استخدام Crossref PubMed Scopus (380) Google Scholar) لفصل الحيوانات المنوية بحركة >90 ٪. تم حضانة معلق الحيوانات المنوية لمدة 10 دقائق، وتم فصل الجزء العلوي 1 مل وتكثيفه لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية (30Visconti P.E. Galantino - Homer H. Ning X. Moore G.D. Valenzuela J.P. Jorgez C.J. Alvarez J.G. Kopf G.S. J. Biol. Chem. 1999; 274: 3235-3242 Abstract full text full text PDF PubMed Scopus (271) Google Scholar). تم حث AR بعد السعة (في وجود أو عدم وجود DPC) في توزيع 30 ميكرولتر بإضافة 5 ZP مكافئ/ميكرولتر أو 15 ميكرومتر A23187. تم الحصول على ZP من بويضات الفئران (31Cross N.L. Meizel S. Biol. Reprod. 1989; 41: 635-641 Crossref PubMed Scopus (173) Google Scholar). تم تحديد النسبة المئوية للواقع المعزز في توزيع 30 ميكرولتر عن طريق إضافة حجم متساوٍ من 10 ٪ من الفورمالديهايد في محلول ملحي مخزن للفوسفات. بعد التثبيت، تم نشر 10 ميكرولتر من السوائل من معلق الحيوانات المنوية على شرائح زجاجية وتجفيفها في الهواء. تم تلطيخ الشرائح بـ 0.22 ٪ Coomassie Blue G -250 في 50 ٪ من الميثانول و 10 ٪ من حمض الخليك الجليدي لمدة 5 دقائق، وشطفها، وتركيبها بـ 50 ٪ (v/v) من الجلسرين في محلول ملحي مخزن للفوسفات (5Munoz - Garay C. De la Vega - Beltran J.L. Delgado R. Labarca P. Felix R. Darszon A. Dev. بيول. 2001 ؛ 234: 261-274 كروسريف بوبميد سكوبس (83) الباحث العلمي من جوجل). تم فحص ما لا يقل عن 100 حيوان منوي لكل حالة تجريبية لحساب النسبة المئوية للواقع المعزز. التحليل الإحصائي - يتم التعبير عن البيانات على أنها متوسط ± S.E. تمت مقارنة المتوسطات باستخدام اختبار t للطالب غير المقترن، واعتبرت p < 0.05 ذات دلالة إحصائية. CFTR موجود في الحيوانات المنوية الثديية - CFTR يعدل العديد من العمليات الخلوية، ويتفاعل مع مختلف القنوات والناقلات الأيونية، وخاصة مع ENaCs (14Guggino WB Stanton B.A. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2006 ؛ 7: 426-436 Crossref PubMed Scopus (350) Google Scholar، 32Sheppard D.N. Welsh M.J. Physiol. مراجعة. 1999 ؛ 79 (S45): S23Crossref PubMed Scopus (813) الباحث العلمي من Google). أبلغنا عن وجود وحدات فرعية αENaC و δENaC في الحيوانات المنوية للفأر (8Hernandez - Gonzalez E.O. Sosnik J. Edwards J. Acevedo J. J. Mendoza - Lujambio I. Lopez - Gonzalez I. Demarco I. Wertheimer E. Darszon A. Visconti P.E.J. Biol. Chem. 2006; 281: 5623-5633 Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (102) Google Scholar) ووجدوا الآن الوحدة الفرعية αENaC في الحيوانات المنوية البشرية (البيانات غير معروضة). فحصنا ما إذا كان CFTR موجودًا في الفأر والحيوانات المنوية البشرية. أولاً، تم تحليل وجود نصوص CFTR باستخدام النسخ العكسي - PCR ؛ تم تصنيع cDNA من إجمالي الحمض النووي الريبوزي المستخرج من قذف الحيوانات المنوية البشرية والخلايا المنوية للفأر المنقى (33Trevino C.L. Felix R. Castellano L.E. Gutierrez C. Rodriguez D. Pacheco J. Lopez - Gonzalez I. Gomora J.C. Tsutsumi V. Hernandez - Cruz A. Fiordelisio T. Scaling A.L. Darszon A. FEBS Lett. 2004 ؛ 563: 87-92 Crossref PubMed Scopus (66) الباحث العلمي من Google). تم تصميم مواد أولية محددة لـ CFTR باستخدام متواليات النيوكليوتيدات البشرية والفأرية المبلغ عنها لهذه الجينات. تم الكشف عن شظايا CFTR للطول المتوقع من الحيوانات المنوية البشرية (476 نقطة أساس) والخلايا المنوية للفأر (581 نقطة أساس) cDNA (الشكل. 1 أ)، وتم تأكيد هوياتهم من خلال تسلسل الحمض النووي. نظرًا لأن التعبير عن نصوص CFTR في الحيوانات المنوية للفئران وفي الحيوانات المنوية البشرية لا يعني وجود بروتين CFTR في الحيوانات المنوية الناضجة، فقد أجريت تجارب اللطخة الغربية والفلورة المناعية باستخدام جسم مضاد متعدد النسيلة مضاد لـ CFTR. اكتشف هذا الجسم المضاد نطاقًا بروتينيًا بالوزن الجزيئي المتوقع في كل من الحيوانات المنوية البشرية والفأرية، وكذلك في المستخلصات الكاملة من رئة الفأر التي تم تضمينها كعنصر تحكم إيجابي (الشكل 1 ب). في كل هذه الحالات، أدى الحضانة المسبقة للببتيد المستضد CFTR إلى القضاء على إشارة البقعة الغربية (الشكل 1 ب). باستخدام نفس الجسم المضاد، تم تحصين CFTR إلى منتصف جسم الإنسان (الشكل 1C) والحيوانات المنوية للفأر (الشكل 1E). تجدر الإشارة إلى أن αENaC مترجمة إلى نفس منطقة الحيوانات المنوية (8 Hernandez - Gonzalez E.O. Sosnik J. Edwards J. Acevedo J. J. Mendoza - Lujambio I. Lopez - Gonzalez I. Demarco I. Wertheimer E. Darszon A. Visconti P.E. J. Biol. Chem. 2006; 281: 5623-5633 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (102) Google Scholar). أدى الحضانة السابقة للجسم المضاد مع الببتيد المستضدي المعني إلى منع إشارة التألق المناعي (الشكل 1 و د و و). يشارك CFTR في فرط الاستقطاب المرتبط بالسعة - نظرًا لأن CFTR عبارة عن قناة Cl -، فقد يساهم في استراحة الحيوانات المنوية للفأر Em والتغييرات التي يمر بها أثناء السعة. ومن المثير للاهتمام، أن DPC 250 ميكرومتر، الذي يمنع CFTR، كان قادرًا على منع الاستقطاب المفرط المرتبط بالسعة دون التأثير على Em للحيوانات المنوية المحتضنة في ظل ظروف لا تدعم السعة (الشكل 2). من ناحية أخرى، فإن الحيوانات المنوية غير المكبوتة التي تحضن 10 دقائق مع 10 ميكرومتر جينيستين، وهو مركب ينشط CFTR، تخضع لفرط استقطاب أكبر من ذلك الذي يصاحب السعة. والجدير بالذكر أن فرط الاستقطاب الناجم عن الجينيستين قد تم حظره بواسطة DPC. تشير هذه النتائج إلى أن تنشيط CFTR يؤثر على الحيوانات المنوية (الشكل 2، A و B). تشارك CFTR في السعة - مع الأخذ في الاعتبار أن DPC منعت الاستقطاب المفرط المرتبط بالسعة، استكشفنا ما إذا كان تثبيط CFTR قادرًا أيضًا على منع عملية السعة. تم استخدام بروتوكولين تجريبيين. 1) تم تكثيف الحيوانات المنوية للفأر في وجود أو عدم وجود 250 ميكرومتر DPC، ثم تم حث AR بإضافة ZP. 2) تم تكثيف الحيوانات المنوية في غياب DPC ثم حضنتها لمدة 5 دقائق مع DPC، قبل الحث مباشرة