L'organisation macromoléculaire au sein de la salive a été étudiée par des mesures de diffusion de traceurs de microsphères de polystyrène fluorescent par récupération de fluorescence après photoblanchiment au microscope confocal (confocal-FRAP). Il y avait une réduction dépendante de la concentration de la diffusion des microsphères ; celle-ci était beaucoup plus importante en présence de calcium (10 mm) et a été réduite par l'ajout d'EGTA (10 mm). Ces effets sur la diffusion des traceurs ont montré que la salive native contenait une organisation macromoléculaire sensible aux concentrations de calcium libre. Ceci a été soutenu par une augmentation majeure du poids moléculaire moyen en poids de la fraction de mucine de haut poids moléculaire dans la salive (10–62 × 106) et une augmentation de la viscosité intrinsèque de la salive (733 à 1203 ml/g) toutes deux causées par le calcium. L'analyse du changement de diffusion du traceur dans la salive a montré une augmentation de 20 fois de la taille apparente des pores (de 130 nm dans le CaCl2 10 mm à 2600 nm dans l'EGTA 10 mm à la concentration physiologique). L'effet était spécifique pour le calcium et n'était pas affecté par jusqu'à 2 m de NaCl. L'activité de liaison au calcium était contenue dans une fraction de salive à densité de flottabilité élevée exclue de Sépharose CL-2B. La liaison du calcium à cette fraction a donné un K d approximatif de 7 × 10–6m, et la liaison a été irréversiblement détruite par un traitement avec du chlorure de guanidinium de 6 m et par une légère réduction, ce qui suggère qu'il s'agit d'un site protéique. Il a été démontré que cette fraction de salive contient MUC5B comme seule espèce protéique majeure par analyse par spectrométrie de masse en tandem par ionisation à électronébulisation positive. Les résultats suggèrent que le MUC5B oligomère dans la salive est assemblé en assemblages linéaires ou ramifiés beaucoup plus grands par le biais de réticulations protéiques médiées par le calcium. L'organisation macromoléculaire au sein de la salive a été étudiée par des mesures de diffusion de traceurs de microsphères de polystyrène fluorescent par récupération de fluorescence après photoblanchiment au microscope confocal (confocal-FRAP). Il y avait une réduction dépendante de la concentration de la diffusion des microsphères ; celle-ci était beaucoup plus importante en présence de calcium (10 mm) et a été réduite par l'ajout d'EGTA (10 mm). Ces effets sur la diffusion des traceurs ont montré que la salive native contenait une organisation macromoléculaire sensible aux concentrations de calcium libre. Ceci a été soutenu par une augmentation majeure du poids moléculaire moyen en poids de la fraction de mucine de haut poids moléculaire dans la salive (10–62 × 106) et une augmentation de la viscosité intrinsèque de la salive (733 à 1203 ml/g) toutes deux causées par le calcium. L'analyse du changement de diffusion du traceur dans la salive a montré une augmentation de 20 fois de la taille apparente des pores (de 130 nm dans le CaCl2 10 mm à 2600 nm dans l'EGTA 10 mm à la concentration physiologique). L'effet était spécifique pour le calcium et n'était pas affecté par jusqu'à 2 m de NaCl. L'activité de liaison au calcium était contenue dans une fraction de salive à densité de flottabilité élevée exclue de Sépharose CL-2B. La liaison du calcium à cette fraction a donné un K d approximatif de 7 × 10–6m, et la liaison a été irréversiblement détruite par un traitement avec du chlorure de guanidinium de 6 m et par une légère réduction, ce qui suggère qu'il s'agit d'un site protéique. Il a été démontré que cette fraction de salive contient MUC5B comme seule espèce protéique majeure par analyse par spectrométrie de masse en tandem par ionisation à électronébulisation positive. Les résultats suggèrent que le MUC5B oligomère dans la salive est assemblé en assemblages linéaires ou ramifiés beaucoup plus grands par le biais de réticulations protéiques médiées par le calcium. Le mucus forme un gel viscoélastique qui recouvre les surfaces épithéliales chez l'homme et les autres vertébrés. Les propriétés du gel ont été interprétées comme étant principalement dues à l'enchevêtrement des mucines oligomères longues et de haut poids moléculaire (1Carlstedt I. Sheehan J.K. Corfield A.P. Gallagher J.T. Essays Biochem. 1985 ; 20: 40-76PubMed Google Scholar, 2Verdugo P. Aitken M. Langley L. Villalon M.J. Biorheology. 1987 ; 24: 625-633Crossref PubMed Scopus (69) Google Scholar). Le mucus a également été décrit comme un réseau faiblement réticulé par des liaisons non covalentes (3Crowther R.S. Marriott C. James S.L. Biorheology. 1984 ; 21: 253-263Crossref PubMed Scopus (41) Google Scholar, 4Steiner c.a. Litt M. Nossal R. Biorheology. 1984 ; 21: 235-252Crossref PubMed Scopus (20) Google Scholar) et les mécanismes d'interaction suggérés ont inclus des interactions hydrophobes interchaînes (5Bromberg L.E. Barr D.P. Biomacromolecules. 2000 ; 1: 325-334Crossref PubMed Scopus (62) Google Scholar) et les interactions glucides-glucides entre les mucines (6McCullagh C.M. Jamieson A.M. Blackwell J. Gupta R. Biopolymers. 1995 ; 35: 149-159Crossref PubMed Scopus (36) Google Scholar, 7Sellers L.A. Allen A. Morris E.R. Ross-Murphy S.B. Biochim. Biophys. Acta. 1991 ; 1115: 174-179Crossref PubMed Scopus (38) Google Scholar, 8Shogren R. Jamieson A.M. Blackwell J. Cheng P.W. Dearborn D.G. Boat T.F. Biopolymers. 1983 ; 22: 1657-1675Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar, 9Soby L.M. Jamieson A.M. Blackwell J. Jentoft N. Biopolymers. 1990 ; 29: 1359-1366Crossref PubMed Scopus (15) Google Scholar). La rhéologie du mucus est affectée par de nombreux facteurs, dont l'hydratation (2Verdugo P. Aitken M. Langley L. Villalon M.J. Biorheology. 1987 ; 24: 625-633Crossref PubMed Scopus (69) Google Scholar), pH (10Verdugo P. Annu. Rev. Physiol. 1990 ; 52: 157-176Crossref PubMed Scopus (243) Google Scholar), et la teneur en ions (11Glantz P.O. Wirth S.M. Baier R.E. Wirth J.E. Acta Odontol. Scand. 1989 ; 47: 7-15Crossref PubMed Scopus (14) Google Scholar, 12Saltzman W.M. Radomsky M.L. Whaley K.J. Cone R.A. Biophys. J. 1994 ; 66: 508-515Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (311) Google Scholar, 13Beeley J.A. Biochem. Soc. Trans. 1993 ; 21: 133-138Crossref PubMed Scopus (31) Google Scholar). Ainsi, l'organisation supramoléculaire de la couche de mucus est complexe, et la base moléculaire de cette organisation reste mal définie. Une couche de mucus recouvre les surfaces des voies gastro-intestinales, reproductives et respiratoires ainsi que les yeux et la cavité buccale (14Madsen F. Eberth K. Smart J.D. J. Control Release. 1998 ; 50: 167-178Crossref PubMed Scopus (176) Google Scholar). Cette couche est la première ligne de défense du corps contre les insultes chimiques, physiques et biologiques et un changement de cette barrière compromettra la santé. Par exemple, dans les voies respiratoires, la surproduction de mucus aux propriétés rhéologiques aberrantes est une caractéristique de l'asthme, de la fibrose kystique et de la maladie pulmonaire obstructive chronique. Dans ces situations, le changement des propriétés physiques de la barrière entraîne une dégradation de la clairance du mucus des voies respiratoires avec les problèmes concomitants de mauvais échange gazeux, de colonisation bactérienne et d'inflammation (10Verdugo P. Annu. Rev. Physiol. 1990 ; 52: 157-176Crossref PubMed Scopus (243) Google Scholar). Pour mieux comprendre l'organisation du mucus, nous avons récemment utilisé l'analyse de diffusion par récupération de fluorescence après photoblanchiment à l'aide d'un microscope confocal (confocal-FRAP) 1Les abréviations utilisées sont : confocal-FRAP, récupération de fluorescence après photoblanchiment à l'aide d'un microscope confocal ; GdmCl, chlorure de guanidinium ; DTT, dithiothréitol ; ESI-MS-MS, spectrométrie de masse en tandem à ionisation par électronébulisation d'ions positifs ; CENTRES COMMERCIAUX, diffusion de lumière laser multiangle. pour étudier les propriétés de la salive (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002 ; 362: 289-296Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar). Cette technique fournit une approche puissante pour étudier les propriétés des macromolécules en solution concentrée (16Gribbon P. Hardingham T.E. Biophys. J. 1998 ; 75: 1032-1039Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (112) Google Scholar). Il permet de déterminer la mobilité moléculaire dans des mélanges complexes en l'absence de flux et de forces de cisaillement. Dans les travaux initiaux, nous avons caractérisé la dépendance à la concentration de l'auto-diffusion de la mucine MUC5B, la mucine oligomère prédominante présente dans la salive. La mesure de la diffusion translationnelle latérale de microsphères fluorescentes de différentes tailles dans des solutions de mucine MUC5B purifiée et dans la salive native a été utilisée pour fournir une estimation directe de la porosité (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002 ; 362: 289-296Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar, 17Gribbon P. Heng B.C. Hardingham T.E. Biophys. J. 1999 ; 77: 2210-2216Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (100) Google Scholar, 18Gribbon P. Heng B.C. Hardingham T.E. Biochem. J. 2000 ; 350: 329-335Crossref PubMed Scopus (72) Google Scholar, 19DeSmedt S.C. Lauwers A. Demeester J. Engelborghs Y. Demey G. Du M. Macromolecules. 1994 ; 27: 141-146Crossref Scopus (74) Google Scholar, 20Phillies G.D.J. J. Phys. Chem. 1989 ; 93: 5029-5039Crossref Scopus (171) Google Scholar). Les résultats ont montré que le MUC5B purifié formait des solutions concentrées dans une solution saline physiologique dans laquelle il n'y avait aucune preuve d'auto-association, et les propriétés à forte concentration étaient telles que prédites par l'enchevêtrement moléculaire des mucines oligomères (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002 ; 362: 289-296Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar). Les interactions hydrophobes intermoléculaires entre les mucines n'ont pas été détectées, pas plus que les interactions glucides-glucides (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002 ; 362: 289-296Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar). Cependant, la comparaison de la salive native avec les solutions de chlorure de guanidinium (GdmCl) purifié MUC5B dans des conditions ioniques similaires a révélé que la salive avait une porosité beaucoup plus faible que la mucine purifiée à des concentrations comparables, montrant que la salive contenait un niveau d'organisation supplémentaire qui était absent de la mucine MUC5B purifiée (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002 ; 362: 289-296Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar). Dans la présente étude, nous avons étudié la base de l'organisation supplémentaire présente dans la salive, qui réduit la diffusion des traceurs. Matériaux - La trypsine, modifiée par alkylation réductrice pour réduire l'autolyse, a été achetée chez Promega (Southampton, Royaume-Uni). L'acétonitrile (qualité chromatographie liquide haute performance) a été acheté chez Rathburn Chemicals (Walkerburn, Royaume-Uni). Le chlorure de calcium, l'urée, le tris et le chlorure de sodium provenaient de BDH (Poole, Royaume-Uni). Le chlorure de guanidinium (qualité pratique), l'EGTA et l'iodoacétamide ont été achetés auprès de Sigma Chemical Co. (Poole, Royaume-Uni). Les solutions mères de chlorure de guanidinium (∼8 m) ont été traitées au charbon de bois avant utilisation. La colonne Pepmap provenait de Dionex (Camberely, Royaume-Uni) et les colonnes radioactives d'exclusion de taille Calcium-45 (1 mCi), Sephacryl S-1000, Sepharose CL-2B et PD-10 (Sephadex G-25) provenaient d'Amersham Biosciences (Royaume-Uni). Le dithiothréitol (DTT) provenait des laboratoires de Melford (Ipswich, Royaume-Uni) et le chlorure de césium de Q-Biogene (Alexis Ltd., Nottingham, Royaume-Uni). Collecte de salive et détermination de la concentration de MUC5B - La salive humaine entière fraîche a été recueillie auprès de 5 à 10 donneurs sains et centrifugée à 2700 × g pendant 30 min à 4 °C pour éliminer les particules. La préparation était homogène avec un pH de 6,2-7,0. Il a été stocké à 4 °C et a été utilisé dans les 5 jours et n'a montré aucun changement significatif du pH ou des propriétés au cours de cette période. La concentration de mucine MUC5B a été déterminée par des mesures d'indice de réfraction comme décrit précédemment (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002 ; 362: 289-296Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar). Détermination de la viscosité et du poids moléculaire - Trois aliquotes de salive (15 ml) ont été dialysées séparément contre : le tampon A, NaCl 0,1 m, Tris 20 mm, pH 7,0 ; le tampon B, le même tampon avec EGTA 10 mm ; ou le tampon C, le même tampon avec CaCl2 10 mm. Le dialysat de chaque échantillon a été conservé comme tampon de contrôle. Pour la détermination du poids moléculaire, les échantillons dialysés ont été chromatographiés sur une colonne Sephacryl S-1000 (300 × 10 mm) éluée avec leur tampon respectif (tampons A–C) à un débit de 12 ml/h. La masse moléculaire moyenne en masse a été déterminée à l'aide d'un photomètre multiangle à diffusion de lumière laser (MALLS) en ligne et d'un réfractomètre différentiel (Dawn DSP, Wyatt Technology, Santa Barbara, CA). Pour chaque échantillon, l'analyse du poids moléculaire moyen en poids a été réalisée en intégrant le pic majeur de mucine de haut poids moléculaire entre 6 et 15 ml de volume d'élution avec un incrément de réfraction (dn/dc) de 0,160 ml/g. Les déterminations de viscosité ont été effectuées dans un viscosimètre capillaire Ostwald à une température constante de 25 °C. Les échantillons ont été dilués dans leurs tampons respectifs (A–C) pour donner une concentration comprise entre 29 et 204 μg/ml. Pour chaque échantillon, le temps d'écoulement dans le viscosimètre a été mesuré cinq fois et moyenné. Viscosité intrinsèque [η]=limc→0ηspecc=limc→0t-t0t0c(Eq. 1) Où t et t 0 sont les temps d'écoulement de l'échantillon et du tampon, respectivement, et c est la concentration de mucine MUC5B. La viscosité intrinsèque [η] a été mesurée en traçant la viscosité réduite en fonction de la concentration en mucine (tracé de Huggins). À partir de l'équation 1, la ligne droite ajustée à concentration nulle a donné la viscosité intrinsèque. Les corrélations linéaires étaient toutes supérieures à 0,98. MUC5B Mucin Preparation from Saliva under Denating Conditions—MUC5B mucins were purified from saliva, by established methods (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002 ; 362: 289-296Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar). La salive a été initialement équilibrée dans 6 m GdmCl et fractionnée par chromatographie d'exclusion de taille et centrifugation à gradient de densité en deux étapes dans 4 m GdmCl. Cette préparation a été dialysée en solutions ioniques pertinentes avant les mesures. Préparation de la mucine à partir de la salive dans des conditions non dénaturantes - La salive fraîche a été doucement agitée pendant une nuit à 4 °C avec un volume égal de 0,2 m de NaCl. Le pH était de 6,2-7,0. Après centrifugation (4400 × g, 30 min, 4 °C), le surnageant a été fractionné par centrifugation en gradient de densité à l'équilibre (densité de départ, 1,45 mg/ml) dans CsCl/0,1 m NaCl, pH 6,5, dans un rotor Beckman Ti45 à 40 000 tr/min pendant 65 h à 15 °C. Les fractions de haute densité contenant de la mucine MUC5B ont été regroupées, dialysées contre du NaCl 0,1 m, pH 6,5, et stockées à 4 °C après l'addition d'azoture de sodium à 0,05% (p/v). Une fraction de 25 ml de cette préparation a été chromatographiée sur une colonne d'exclusion de taille (1000 x x 52 mm, Sépharose CL-2B) éluée dans 0,1 m NaCl, 10 mm EGTA, pH 8,0, à un débit de 24 ml/h. Les fractions de mucine MUC5B, dans le volume vide de la colonne, ont été regroupées et dialysées contre du NaCl 0,1 m, pH 6,5, et une partie a été concentrée contre du polyéthylène glycol (5% p/v) et testée pour les effets dépendants du calcium sur la diffusion des traceurs par confocal-FRAP. Identification des protéines par spectrométrie de masse - Une aliquote de la fraction à haute densité contenant de la mucine MUC5B purifiée par gradient de densité CsCl dans des conditions non dénaturantes (voir ci-dessus) a été réduite (TNT de 10 mm pendant 2 h) et alkylée (iodoacétamide de 25 mm pendant 30 min à l'obscurité), puis dialysée contre l'eau et lyophilisée. En outre, une aliquote de 5 ml de la fraction groupée contenant de la mucine MUC5B de haute densité a été chromatographiée sur une colonne d'exclusion de taille (600 × 10 mm, Sépharose CL-2B) éluée dans 0,1 m NaCl, pH 6,5, contenant 10 mm CaCl2 à un débit de 60 ml/h. La fraction de volume vide a été réduite et alkylée comme décrit ci-dessus. Les deux préparations ont été digérées pendant la nuit à 37 °C avec 1 μg de trypsine pour 10 μg de protéine dans du bicarbonate d'ammonium 100 mm pH 8,0. Les peptides tryptiques ont été séparés par chromatographie en phase inverse et analysés en ligne par ion positif ESI-MS-MS à l'aide d'un micro spectromètre de masse Q-ToF (Micromass, Manchester, Royaume-Uni). Les échantillons ont été introduits via un système de chromatographie liquide capillaire équipé d'un module de sélection de flux (Micromass). Des aliquotes (10–50 μl) des échantillons ont été séparées sur une colonne Pepmap (0,075 × 150 mm) avec un gradient de 5% d'acétonitrile dans l'acide formique 0,1% à 25% d'acétonitrile dans l'acide formique 0,1% en 30 min à un débit de 200 nl/min. Ce processus a été répété deux fois pour chaque échantillon, et les peptides identifiés dans la première série ont été exclus de la deuxième analyse. Les données acquises ont été analysées à l'aide des bases de données SwissProt et Trembl à l'aide du logiciel Proteinlynx global server 1.1 (Micromass). Les paramètres ont été définis sur la tolérance de masse peptidique de 100 mDa, l'oxydation de la méthionine et la modification de la carboxyamidométhyl cystéine. Le spectre MS-MS de chaque peptide apparié a été examiné individuellement, les critères d'acceptation étant que les masses ioniques parentales et fragmentaires se trouvaient dans les limites de tolérance calibrées et que le spectre contenait une série d'au moins quatre ions y′ consécutifs. Préparation des échantillons pour les mesures de diffusion des traceurs - Pour toutes les mesures de diffusion des traceurs, microsphères de polystyrène fluorescent (diamètre moyen 499 nm), préincubées avec de l'albumine de sérum bovin (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002 ; 362: 289-296Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar), ont été mélangés, 2% (p/v), avec les échantillons, et équilibrés pendant la nuit à 4 °C. Toutes les mesures confocales-FRAP sur la salive et les solutions de MUC5B ont été effectuées en présence de 0,1 m NaCl, pH 6,2-7,0 et à 25 °C, sauf dans les expériences sur la dépendance à la température dans lesquelles les échantillons ont été équilibrés pendant 30 min à des températures de 15-52,5 °C. Pour déterminer la dépendance de la concentration de la diffusion des traceurs, la salive a été initialement concentrée par dialyse contre l'aquacide. Pour les mesures en présence ou en absence de CaCl2 10 mm, la concentration de MUC5B dans la salive était jusqu'à 0,1 mg/ml. En présence d'EGTA de 10 mm, la concentration de MUC5B atteignait 0,960 mg/ml. Les échantillons MUC5B purifiés dans des conditions dénaturantes ont été dilués dans du NaCl 0,1 m, pH 6,5, et des mesures ont été effectuées sur des solutions allant jusqu'à 1,29 mg/ml. Pour déterminer les effets des cations sur la diffusion des traceurs, les sels de cations divalents (CaCl2, MgCl2, MnCl2 et ZnCl2) ou EGTA ont été ajoutés pour donner des concentrations finales allant jusqu'à 4 mm. Pour évaluer la réversibilité des effets, après l'ajout de CaCl2, l'EGTA a été ajouté à une concentration équivalente au CaCl2 et les mesures confocales-FRAP ont été répétées. Pour déterminer l'effet du détergent sur la diffusion du traceur, du Triton X-100 jusqu'à 2 % (v/v) a été ajouté aux solutions salivaires. Mesures de diffusion par récupération de fluorescence Confocal-FRAP après des expériences de photoblanchiment ont été réalisées à l'aide d'un microscope laser confocal (MRC-1000, Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK) avec un microscope à épifluorescence vertical (Optiphot 2, Nikon, Japon) (16Gribbon P. Hardingham T.E. Biophys. J. 1998 ; 75: 1032-1039Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (112) Google Scholar). Pour les expériences de diffusion de traceurs, des échantillons de 10 μl contenant des microsphères de 499 nm ont été scellés sous des lamelles de verre sur une lame de microscope plate. La technique confocal-FRAP détermine les coefficients de diffusion translationnelle latérale, qui ont été calculés à partir de la dépendance temporelle des tracés du deuxième moment de la distribution moyenne radiale du fluorophore blanchi (16Gribbon P. Hardingham T.E. Biophys. J. 1998 ; 75: 1032-1039Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (112) Google Scholar, 17Gribbon P. Heng B.C. Hardingham T.E. Biophys. J. 1999 ; 77: 2210-2216Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (100) Google Scholar, 18Gribbon P. Heng B.C. Hardingham T.E. Biochem. J. 2000 ; 350: 329-335Crossref PubMed Scopus (72) Google Scholar, 21Kubitscheck U. Wedekind P. Peters R. Biophys. J. 1994 ; 67: 948-956Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (71) Google Scholar). Cinq répétitions ont été effectuées pour chaque expérience. Dans les expériences de dépendance à la température, la température a été contrôlée à l'aide d'un système de refroidissement et de chauffage (PE-60, Linkam Instruments, Tadworth, Royaume-Uni) fixé au support de lame sur le microscope confocal. La dépendance de la concentration des coefficients de diffusion translationnelle du traceur dans la salive et le MUC5B purifié a été calculée à l'aide de l'équation d'échelle pour la diffusion du traceur dans les réseaux de polymères semi-dilués (20Phillies G.D.J. J. Phys. Chem. 1989 ; 93: 5029-5039Crossref Scopus (171) Google Scholar) dans l'équation 2, D=D0exp(-βcν)(Eq. 2) où D est le coefficient de diffusion du traceur translationnel latéral apparent mesuré, D 0 est son coefficient de diffusion libre, et β et ν sont des constantes empiriques et sont liées à la taille moyenne des pores du réseau ξ (19DeSmedt S.C. Lauwers A. Demeester J. Engelborghs Y. Demey G. Du M. Macromolécules. 1994 ; 27: 141-146Crossref Scopus (74) Google Scholar) (Équation 3), qui décrit la distance entre les points d'enchevêtrement de chaînes (22De Gennes P.G. Scaling Concepts in Polymer Physics. Cornell University Press, Ithaca, NY1979Google Scholar) dans l'équation 3. ξ=-d/ln(D/D0)(Eq. 3) Dans cette équation, d est le diamètre du traceur. Cela suppose que le polymère forme un réseau régulier de brins liés. Pour les polymères, tels que les solutions de mucine, dans lesquels les associations interchaînes sont transitoires et le réseau formé serait dynamique, ξ est une dimension moyenne représentant une distribution des tailles de pores apparentes. Dans les solutions semi-diluées de polymères, cette analyse de la diffusion des traceurs, qui donne une taille de pore apparente, fournit donc une mesure combinée de l'enchevêtrement des chaînes, ainsi que tout effet supplémentaire d'association interchaîne spécifique. Liaison au calcium - La liaison du calcium à la fraction de mucine MUC5B de haute densité purifiée dans des conditions douces non dénaturantes a été évaluée par chromatographie d'exclusion stérique. À la fraction de mucine (500 μl à 50 μg/ml dans du NaCl 0,1 m, pH 6,5), 45CaCl2 (3,256 Ci/mmol) a été ajouté à une concentration finale de 70 μm et incubé pendant une nuit à température ambiante. L'échantillon a été chromatographié sur une colonne de Sépharose CL-2B (6 x 100 mm) éluée dans du NaCl 0,1 m, pH 6,5. Des fractions (250 μl) ont été recueillies et la radioactivité a été mesurée par comptage par scintillation. La liaison au calcium a également été déterminée (comme ci-dessus) après traitement de la fraction de mucine de haute densité avec 6 m GdmCl. Un échantillon de la mucine a été dialysé en GdmCl 6 m (pH 6,2) pendant une nuit à 4 °C, puis de nouveau en NaCl 0,1 m, pH 6,5, avant l'addition de 45CaCl2 radioactif. La fraction de mucine de haute densité a également été traitée en ajoutant 10 mm DTT pendant 30 min à 37 °C avant l'incubation avec du calcium radioactif pendant une nuit à température ambiante et par chromatographie (comme ci-dessus). Pour estimer l'affinité de la liaison au calcium, différentes concentrations de 45CaCl2 radioactif (0,63 à 15,8 μm, 3,256 Ci/mmol) ont été ajoutées à 500 μl de la fraction de mucine de haute densité (concentration de MUC5B 15 μg/ml dans 0,1 m NaCl, pH 6,5). Les échantillons ont été chromatographiés sur des colonnes d'exclusion de taille PD-10 (Sephadex G-25) éluées dans du NaCl 25 mm, du Tris 20 mm, pH 7,0, et la radioactivité en fractions (500 μl) a été mesurée par comptage par scintillation. Des travaux antérieurs mesurant la diffusion de traceurs de microsphères de polystyrène fluorescentes par confocal-FRAP ont montré que la mucine MUC5B salivaire purifiée au GdmCl était beaucoup plus perméable à la diffusion de traceurs que la salive à des concentrations similaires de mucine MUC5B (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002 ; 362: 289-296Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar). Nous avons donc étudié davantage les propriétés de la salive pour découvrir la base de cette différence d'organisation moléculaire. La diffusion du traceur dans la salive et la solution de MUC5B purifiée au GdmCl a montré une réduction de la diffusion des microsphères (diamètre de 499 nm) en fonction de la concentration (Fig. 1A). Cela a suivi la forme générale prédite pour l'enchevêtrement de polymères de haut poids moléculaire (voir l'équation 2) (20Phillies G.D.J. J. Phys. Chem. 1989 ; 93: 5029-5039Crossref Scopus (171) Google Scholar). À partir des résultats de la diffusion du traceur, le changement de la taille apparente des pores avec la concentration a été calculé (voir « Procédures expérimentales », Équation 3) (Fig. 1B). Cela a montré que la taille apparente des pores dans la solution de MUC5B purifiée au GdmCl était quatre fois plus grande que dans la salive, extrapolée à une concentration de MUC5B similaire (100 μg/ml) proche de celle trouvée physiologiquement. La différence n'était pas due aux effets de force ionique, car les deux préparations ont été analysées dans du NaCl 0,1 m. Pour comprendre la base de la différence de taille apparente des pores, nous avons effectué d'autres expériences de diffusion de traceurs sur la salive à des concentrations de MUC5B dans le milieu de la courbe concentration-dépendance (45–55 μg/ml, Fig. 1A) .À cette concentration, tout changement dans la diffusion du traceur reflète donc des changements dans l'organisation des macromolécules dans la salive qui déterminent le taux de diffusion. Effet du calcium et de l'EGTA sur la salive - L'ajout de CaCl2, jusqu'à 4 mm à la salive dans du NaCl 0,1 m, a provoqué une diminution majeure de la diffusion des microsphères, qui est passée de 5,6 × 10–9 à 1,8 × 10–9 cm2.s-1 (Fig. 1C). À partir de ces mesures de diffusion, la taille apparente des pores de la salive (calculée à partir de l'équation 3, voir « Procédures expérimentales ») a diminué d'environ1200 à 300 nm après l'ajout de 4 mm de CaCl2 (Fig. 1D). Dans une expérience similaire à la même concentration de salive, l'ajout d'EGTA a augmenté la diffusion du traceur (Fig. 1C), et à plus de 3 mm EGTA la diffusion est devenue égale à la diffusion libre. Le résultat suggère que l'EGTA chélatait le calcium dans la salive et provoquait une augmentation de la diffusion des traceurs. La taille des pores apparente calculée a augmenté d'environ1200 à 7000 nm en présence de 2,5 mm d'EGTA (Fig. 1D). La taille apparente des pores de la salive à partir des mesures de diffusion des traceurs a donc été multipliée par six par l'EGTA. Ces changements majeurs dans la diffusion des traceurs à concentration constante de la salive suggèrent que le calcium a un effet majeur sur l'organisation des macromolécules dans la salive. La réversibilité de cet effet a été démontrée par l'analyse confocale-FRAP d'un échantillon traité à l'EGTA puis rééquilibré au calcium et re-testé. La diffusion du traceur augmentée par l'EGTA est revenue à un faible taux en présence de calcium (résultats non présentés). L'effet du calcium était indépendant du pH dans l'intervalle neutre pH 6–8 (résultats non montrés). Les expériences ont suggéré que le calcium était facilement lié et retiré des sites d'interaction et que le changement dans l'organisation macromoléculaire de la salive était librement réversible. Une évaluation plus complète des effets du calcium sur la diffusion des traceurs sur toute la gamme de concentration de salive a été obtenue (Fig. 1A). Il y a eu une réduction majeure de la diffusion des traceurs dans toute la gamme de concentrations par rapport à la salive non traitée, avec l'effet détecté à de très faibles concentrations de MUC5B (5,5 μg/ml). En revanche, en présence d'EGTA, la salive était beaucoup plus perméable à la diffusion des traceurs, et les effets sur la diffusion des microsphères n'ont été détectés qu'à partir de 240 μg/ml (Fig. 1A). D'après ces résultats, la taille apparente des pores a montré une différence d'environ 20 fois entre la salive traitée à l'EGTA et au CaCl2 (tableau I) lorsqu'elle est comparée à une concentration physiologique. Fait intéressant, la diffusion du traceur des microsphères dans la solution de mucine MUC5B purifiée au GdmCl a montré une dépendance de concentration similaire à celle de la salive traitée avec de l'EGTA (Fig. 1A).Tableau IAnalyse de la diffusion du traceurConcentration critiqueDiffusion latérale D0 × 10-9Taille estimée (ξ) à 100 μg/ml de MUC5Bμg/mlcm2 s-1nmSaliva36.910.9620Saliva plus 10 mm CaCl25.58.6130Saliva plus 10 mm EGTA24012.92600GdmCl MUC5B32412.92710GdmCl MUC5B plus 10 mm CaCl232013.22740 Table ouverte dans un nouvel onglet Ces observations initiales des effets du calcium sur la diffusion du traceur ont été étudiées plus avant en mesurant deux autres propriétés indépendantes. La viscosité de la salive était similaire à celle précédemment déterminée par d'autres dans des conditions ioniques similaires (23Nordbo H. Darwish S. Bhatnagar R.S. J. DENT. Res. 1984 ; 92: 306-314Google Scholar, 24Veerman E.C.I. Valentijn-benz M. Nieuw Amerogen A.V. J. Biol. Buccale. 1989 ; 17: 297-306PubMed Google Scholar). Cependant, avec l'ajout de 10 mm de CaCl2, il y a eu une forte augmentation de la viscosité intrinsèque (1033 à 1233 ml/g), et avec 10 mm d'EGTA, il y a eu une forte diminution de la viscosité intrinsèque (1033 à 733 ml/g) (Fig. 2A et tableau II). La présence de calcium rend ainsi la salive plus visqueuse. L'analyse de la salive native par filtration sur gel sur S-1000 combinée à l'analyse des CENTRES COMMERCIAUX a montré qu'elle contenait une fraction de poids moléculaire élevé avec un poids moléculaire moyen en poids approximatif de 28 × 106. En présence de CaCl2 (10 mm), la distribution des poids moléculaires de la même fraction de poids moléculaire élevé a montré une augmentation majeure à ∼62 × 106, et cela a été réduit de façon spectaculaire à ∼10 × 106 en présence d'EGTA (10 mm) (Fig. 2B et tableau II). Le calcium a donc provoqué une augmentation majeure de (a) la viscosité de la salive et (b) du poids moléculaire moyen des composants de haut poids moléculaire dans la salive. Tableau IIViscosité et distribution du poids moléculaire [η]Poids moléculaire moyen en poids ml ·g-1× 106Saliva103327.6Saliva plus 10 mm CaCl2120361.8Saliva plus 10 mm EGTA73310.1 Tableau ouvert dans un nouvel onglet Effet de la force ionique du solvant et des cations divalents (Mg2 + , Mn2 + et Zn2 + ) sur la diffusion du traceur dans la salive - L'effet du calcium sur la diffusion du traceur dans la salive n'a pas été affecté par la concentration de NaCl 0,1 à 2 m (Fig. 3A). Il est donc peu probable que l'effet du calcium soit dû à une simple interaction électrostatique entre les macromolécules de la salive. Les effets d'autres ions divalents ont été étudiés. Avec l'ajout de MgCl2, MnCl2 et ZnCl2 jusqu'à 4 mm, il n'y avait aucun changement dans la diffusion du traceur (Fig. 3B). Les résultats ont montré que d'autres ions métalliques divalents communs ne peuvent pas se substituer aux ions calcium et donc que le calcium a un effet spécifique sur l'organisation macromoléculaire dans la salive. Effet de la température sur la diffusion du traceur dans la salive - La diffusion du traceur a été déterminée sur la salive équilibrée à différentes températures (15-52,5 °C) (Fig. 3C). À mesure que la température augmentait, la diffusion du traceur des microsphères augmentait de 20% sur toute la plage de température, lorsqu'elle était corrigée de l'effet des changements de viscosité du solvant sur la diffusion du traceur. L'effet était réversible, car lors du refroidissement, la diffusion des microsphères diminuait et revenait à la valeur initiale.

La organización macromolecular dentro de la saliva se investigó mediante mediciones de difusión de trazadores de microesferas fluorescentes de poliestireno mediante recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo utilizando un microscopio confocal (confocal-FRAP). Hubo una reducción dependiente de la concentración en la difusión de las microesferas; esta fue mucho mayor en presencia de calcio (10 mm) y se redujo mediante la adición de EGTA (10 mm). Estos efectos sobre la difusión del trazador mostraron que la saliva nativa contenía una organización macromolecular que era sensible a las concentraciones de calcio libre. Esto fue respaldado por un aumento importante en el peso molecular promedio en peso de la fracción de mucina de alto peso molecular en la saliva (10–62 × 106) y un aumento en la viscosidad intrínseca de la saliva (733 a 1203 ml/g), ambos causados por el calcio. El análisis del cambio en la difusión del trazador en la saliva mostró un aumento de 20 veces en el tamaño de poro aparente (de 130 nm en CaCl2 de 10 mm a 2600 nm en EGTA de 10 mm a concentración fisiológica). El efecto fue específico para el calcio y no se vio afectado por hasta 2 m NaCl. La actividad de unión al calcio estaba contenida en una fracción de saliva de alta densidad de flotación excluida de Sepharose CL-2B. La unión de calcio a esta fracción dio un K d aproximado de 7 × 10-6 m, y la unión se destruyó irreversiblemente por tratamiento con cloruro de guanidinio 6 m y por reducción leve, lo que sugiere que es a un sitio de proteína. Se demostró que esta fracción de saliva contiene MUC5B como la única especie de proteína principal mediante análisis de espectrometría de masas en tándem por ionización por electropulverización de iones positivos. Los resultados sugirieron que la MUC5B oligomérica en la saliva se ensambla en ensamblajes lineales o ramificados mucho más grandes a través de reticulaciones de proteínas mediadas por calcio. La organización macromolecular dentro de la saliva se investigó mediante mediciones de difusión de trazadores de microesferas fluorescentes de poliestireno mediante recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo utilizando un microscopio confocal (confocal-FRAP). Hubo una reducción dependiente de la concentración en la difusión de las microesferas; esta fue mucho mayor en presencia de calcio (10 mm) y se redujo mediante la adición de EGTA (10 mm). Estos efectos sobre la difusión del trazador mostraron que la saliva nativa contenía una organización macromolecular que era sensible a las concentraciones de calcio libre. Esto fue respaldado por un aumento importante en el peso molecular promedio en peso de la fracción de mucina de alto peso molecular en la saliva (10–62 × 106) y un aumento en la viscosidad intrínseca de la saliva (733 a 1203 ml/g), ambos causados por el calcio. El análisis del cambio en la difusión del trazador en la saliva mostró un aumento de 20 veces en el tamaño de poro aparente (de 130 nm en CaCl2 de 10 mm a 2600 nm en EGTA de 10 mm a concentración fisiológica). El efecto fue específico para el calcio y no se vio afectado por hasta 2 m NaCl. La actividad de unión al calcio estaba contenida en una fracción de saliva de alta densidad de flotación excluida de Sepharose CL-2B. La unión de calcio a esta fracción dio un K d aproximado de 7 × 10-6 m, y la unión se destruyó irreversiblemente por tratamiento con cloruro de guanidinio 6 m y por reducción leve, lo que sugiere que es a un sitio de proteína. Se demostró que esta fracción de saliva contiene MUC5B como la única especie de proteína principal mediante análisis de espectrometría de masas en tándem por ionización por electropulverización de iones positivos. Los resultados sugirieron que la MUC5B oligomérica en la saliva se ensambla en ensamblajes lineales o ramificados mucho más grandes a través de reticulaciones de proteínas mediadas por calcio. El moco forma un gel viscoelástico que recubre las superficies epiteliales en humanos y otros vertebrados. Se ha interpretado que las propiedades del gel se deben predominantemente al entrelazamiento de las mucinas oligoméricas largas y de alto peso molecular (1Carlstedt I. Sheehan J.K. Corfield A.P. Gallagher J.T. Essays Biochem. 1985; 20: 40-76PubMed Google Scholar, 2Verdugo P. Aitken M. Langley L. Villalon M.J. Biorheology. 1987; 24: 625-633 Crossref PubMed Scopus (69) Google Scholar). El moco también se ha descrito como una red débilmente reticulada por enlaces no covalentes (3Crowther R.S. Marriott C. James S.L. Biorheology. 1984; 21: 253-263 Crossref PubMed Scopus (41) Google Scholar, 4Steiner C.A. Litt M. Nossal R. Biorheology. 1984; 21: 235-252 Crossref PubMed Scopus (20) Google Scholar) y los mecanismos de interacción sugeridos han incluido interacciones hidrófobas intercatenarias (5Bromberg L.E. Barr D.P. Biomacromolecules. 2000; 1: 325-334Crossref PubMed Scopus (62) Google Scholar) y las interacciones carbohidrato-carbohidrato entre las mucinas (6McCullagh C.M. Jamieson A.M. Blackwell J. Gupta R. Biopolymers. 1995; 35: 149-159Crossref PubMed Scopus (36) Google Scholar, 7Sellers L.A. Allen A. Morris E.R. Ross-Murphy S.B. Biochim. Biophys. Acta. 1991; 1115: 174-179Crossref PubMed Scopus (38) Google Scholar, 8Shogren R. Jamieson A.M. Blackwell J. Cheng P.W. Dearborn D.G. Boat T.F. Biopolymers. 1983; 22: 1657-1675 Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar, 9Soby L.M. Jamieson A.M. Blackwell J. Jentoft N. Biopolymers. 1990; 29: 1359-1366 Crossref PubMed Scopus (15) Google Scholar). La reología del moco se ve afectada por muchos factores, incluida la hidratación (2Verdugo P. Aitken M. Langley L. Villalon M.J. Biorheology. 1987; 24: 625-633 Crossref PubMed Scopus (69) Google Scholar), pH (10Verdugo P. Annu. Rev. Physiol. 1990; 52: 157-176Crossref PubMed Scopus (243) Google Scholar), y contenido iónico (11Glantz P.O. Wirth S.M. Baier R.E. Wirth J.E. Acta Odontol. Scand. 1989; 47: 7-15Crossref PubMed Scopus (14) Google Scholar, 12Saltzman W.M. Radomsky M.L. Whaley K.J. Cone R.A. Biophys. J. 1994; 66: 508-515Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (311) Google Scholar, 13Beeley J.A. Biochem. Soc. Trans. 1993; 21: 133-138Crossref PubMed Scopus (31) Google Scholar). Por lo tanto, la organización supramolecular de la capa de moco es compleja, y la base molecular de esta organización sigue estando poco definida. Una capa de moco recubre las superficies de los tractos gastrointestinal, reproductivo y respiratorio, así como los ojos y la cavidad oral (14Madsen F. Eberth K. Smart J.D. J. Control Release. 1998; 50: 167-178 Crossref PubMed Scopus (176) Google Scholar). Esta capa es la primera línea de defensa de los cuerpos contra el daño químico, físico y biológico y un cambio en esta barrera comprometerá la salud. Por ejemplo, en las vías respiratorias, la sobreproducción de moco con propiedades reológicas aberrantes es una característica del asma, la fibrosis quística y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica. En estas situaciones, el cambio en las propiedades físicas de la barrera conduce a una ruptura en la eliminación de moco de las vías respiratorias con los problemas concomitantes de intercambio de gases deficiente, colonización bacteriana e inflamación (10Verdugo P. Annu. Rev. Physiol. 1990; 52: 157-176Crossref PubMed Scopus (243) Google Scholar). Para obtener más información sobre la organización del moco, recientemente hemos empleado el análisis de difusión mediante recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo utilizando un microscopio confocal (confocal-FRAP) 1. Las abreviaturas utilizadas son: confocal-FRAP, recuperación de fluorescencia después del fotoblanqueo utilizando un microscopio confocal; GdmCl, cloruro de guanidinio; DTT, ditiotreitol; ESI-MS-MS, ionización por electropulverización de iones positivos-espectrometría de masas en tándem; MALLS, dispersión de luz láser multiángulo. para estudiar las propiedades de la saliva (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002; 362: 289-296Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar). Esta técnica proporciona un enfoque poderoso para investigar las propiedades de las macromoléculas en solución concentrada (16Gribbon P. Hardingham T.E. Biophys. J. 1998; 75: 1032-1039Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (112) Google Scholar). Permite determinar la movilidad molecular en mezclas complejas en ausencia de fuerzas de flujo y cizallamiento. En el trabajo inicial caracterizamos la dependencia de la concentración de la autodifusión de la mucina MUC5B, la mucina oligomérica predominante presente en la saliva. La medición de la difusión traslacional lateral de microesferas fluorescentes de diferente tamaño en soluciones de mucina MUC5B purificada y en saliva nativa se utilizó para proporcionar una estimación directa de la porosidad (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002; 362: 289-296Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar, 17Gribbon P. Heng B.C. Hardingham T.E. Biophys. J. 1999; 77: 2210-2216Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (100) Google Scholar, 18Gribbon P. Heng B.C. Hardingham T.E. Biochem. J. 2000; 350: 329-335Crossref PubMed Scopus (72) Google Scholar, 19DeSmedt S.C. Lauwers A. Demeester J. Engelborghs Y. Demey G. Du M. Macromolecules. 1994; 27: 141-146Crossref Scopus (74) Google Scholar, 20Phillies G.D.J. J. Phys. Chem. 1989; 93: 5029-5039Crossref Scopus (171) Google Scholar). Los resultados mostraron que MUC5B purificado formó soluciones concentradas en solución salina fisiológica en las que no hubo evidencia de autoasociación, y las propiedades a alta concentración fueron las predichas por el entrelazamiento molecular de las mucinas oligoméricas (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002; 362: 289-296Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar). No se detectaron interacciones hidrofóbicas intermoleculares entre mucinas, ni tampoco interacciones carbohidrato-carbohidrato (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002; 362: 289-296Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar). Sin embargo, la comparación de la saliva nativa con las soluciones de MUC5B purificada de cloruro de guanidinio (GdmCl) en condiciones iónicas similares reveló que la saliva tenía una porosidad mucho menor que la mucina purificada a concentraciones comparables, lo que demuestra que la saliva contenía un nivel adicional de organización que estaba ausente de la mucina MUC5B purificada (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002; 362: 289-296Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar). En el presente estudio, investigamos la base de la organización adicional presente en la saliva, que redujo la difusión del trazador. Materiales: La tripsina, modificada por alquilación reductora para reducir la autólisis, se compró a Promega (Southampton, Reino Unido). El acetonitrilo (grado de cromatografía líquida de alto rendimiento) se adquirió de Rathburn Chemicals (Walkerburn, Reino Unido). El cloruro de calcio, la urea, el Tris y el cloruro de sodio eran de BDH (Poole, Reino Unido). El cloruro de guanidinio (grado práctico), EGTA y yodoacetamida se adquirieron de Sigma Chemical Co. (Poole, Reino Unido). Las soluciones madre de cloruro de guanidinio (~8 m) se trataron con carbón vegetal antes de su uso. La columna Pepmap era de Dionex (Camberely, Reino Unido) y las columnas radiactivas Calcium-45 (1 mCi), Sephacryl S-1000, Sepharose CL-2B y PD-10 de exclusión por tamaño (Sephadex G-25) eran de Amersham Biosciences (Reino Unido). El ditiotreitol (DTT) era de Melford Laboratories (Ipswich, Reino Unido), y el cloruro de cesio era de Q-Biogene (Alexis Ltd., Nottingham, Reino Unido). Recolección de saliva y determinación de la concentración de MUC5B: se recolectó saliva humana entera fresca de 5–10 donantes sanos y se centrifugó a 2700 × g durante 30 min a 4 °C para eliminar la materia particulada. La preparación era homogénea con un pH de 6.2–7.0. Se almacenó a 4 °C y se usó en 5 días y no mostró cambios significativos en el pH o las propiedades durante este tiempo. La concentración de mucina MUC5B se determinó mediante mediciones del índice de refracción como se describió anteriormente (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002; 362: 289-296Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar). Viscosidad y determinación del peso molecular: se dializaron tres alícuotas de saliva (15 ml) por separado contra: tampón A, NaCl 0,1 M, Tris 20 mm, pH 7,0; tampón B, el mismo tampón con EGTA 10 mm; o tampón C, el mismo tampón con CaCl2 10 mm. El dializado de cada muestra se mantuvo como tampón de control. Para la determinación del peso molecular, las muestras dializadas se cromatografiaron en una columna Sephacryl S-1000 (300 × 10 mm) eluida con su respectivo amortiguador (amortiguadores A–C) a una velocidad de flujo de 12 ml/h. La masa molecular promedio en masa se determinó utilizando un fotómetro de dispersión de luz láser multiángulo en línea (MALLS) y un refractómetro diferencial (Dawn DSP, Wyatt Technology, Santa Barbara, CA). Para cada muestra, el análisis del peso molecular promedio en peso se llevó a cabo integrando el pico principal de mucina de alto peso molecular entre 6 y 15 ml de volumen de elución con un incremento de refracción (dn/dc) de 0.160 ml/g. Las determinaciones de viscosidad se llevaron a cabo en un viscosímetro capilar Ostwald a una temperatura constante de 25 °C. Las muestras se diluyeron en sus respectivos amortiguadores (A–C) para dar una concentración entre 29 y 204 μg/ml. Para cada muestra, el tiempo de flujo en el viscosímetro se midió cinco veces y se promedió. Viscosidadintrínseca [η]=limc→0ηspecc=limc→0t-t0t0c(Ec. 1) Donde t y t 0 son los tiempos de flujo de la muestra y el amortiguador, respectivamente, y c es la concentración de mucina MUC5B. La viscosidad intrínseca [η] se midió trazando la viscosidad reducida en función de la concentración de mucina (gráfico de Huggins). A partir de la Ecuación 1, la línea recta ajustada a concentración cero dio la viscosidad intrínseca. Las correlaciones en línea recta fueron todas superiores a 0,98. Preparación de mucina MUC5B a partir de saliva en condiciones desnaturalizantes Las mucinas MUC5B se purificaron a partir de saliva, mediante métodos establecidos (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002; 362: 289-296Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar). La saliva se equilibró inicialmente en 6 m GdmCl y se fraccionó mediante cromatografía de exclusión por tamaño y centrifugación en gradiente de densidad de dos etapas en 4 m GdmCl. Esta preparación se dializó en soluciones iónicas relevantes antes de las mediciones. Preparación de mucina a partir de saliva en condiciones no desnaturalizantes: la saliva fresca se agitó suavemente durante la noche a 4 °C con un volumen igual de NaCl 0,2 m. El pH fue de 6,2-7,0. Después de la centrifugación (4400 × g, 30 min, 4 °C), el sobrenadante se fraccionó mediante centrifugación en gradiente de densidad de equilibrio (densidad inicial, 1.45 mg/ml) en CsCl/NaCl 0.1 m, pH 6.5, en un rotor Beckman Ti45 a 40,000 rpm durante 65 h a 15 °C. Las fracciones de alta densidad que contenían mucina MUC5B se agruparon, se dializaron contra NaCl 0.1 m, pH 6.5 y se almacenaron a 4 °C después de la adición de azida de sodio al 0.05% (p/v). Una fracción de 25 ml de esta preparación se cromatografió en una columna de exclusión por tamaño (1000 × x 52 mm, Sepharose CL-2B) eluida en NaCl 0.1 m, EGTA 10 mm, pH 8.0, a una velocidad de flujo de 24 ml/h. Las fracciones de mucina MUC5B, en el volumen vacío de la columna, se agruparon y dializaron contra NaCl 0.1 m, pH 6.5, y parte se concentró contra polietilenglicol (5% p/v) y se analizaron los efectos dependientes de calcio sobre la difusión del trazador mediante confocal-FRAP. Identificación de proteínas por espectrometría de masas: una alícuota de la fracción que contiene mucina MUC5B de alta densidad purificada por gradiente de densidad de CsCl en condiciones no desnaturalizantes (véase anteriormente) se redujo (DTT de 10 mm durante 2 h) y se alquiló (yodoacetamida de 25 mm durante 30 min en la oscuridad) y luego se dializó contra agua y se liofilizó. Además, se cromatografió una alícuota de 5 ml de la fracción combinada que contenía mucina MUC5B de alta densidad en una columna de exclusión por tamaño (600 × 10 mm, Sepharose CL-2B) eluida en NaCl 0,1 m, pH 6,5, que contenía CaCl2 10 mm a una velocidad de flujo de 60 ml/h. La fracción de volumen vacío se redujo y alquiló como se describió anteriormente. Ambas preparaciones se digirieron durante la noche a 37 °C con 1 μg de tripsina por 10 μg de proteína en bicarbonato de amonio 100 mm pH 8,0. Los péptidos trípticos se separaron mediante cromatografía de fase inversa y se analizaron en línea mediante ESI-MS-MS de iones positivos utilizando un microespectrómetro de masas Q-ToF (Micromass, Manchester, Reino Unido). Las muestras se introdujeron a través de un sistema de cromatografía líquida capilar equipado con un módulo de selección de corriente (Micromass). Se separaron alícuotas (10–50 μl) de las muestras en una columna Pepmap (0,075 × 150 mm) con un gradiente de acetonitrilo al 5% en ácido fórmico al 0,1% a acetonitrilo al 25% en ácido fórmico al 0,1% durante 30 min a una velocidad de flujo de 200 nl/min. Este proceso se repitió dos veces para cada muestra, y los péptidos identificados en la primera ejecución se excluyeron del segundo análisis. Los datos adquiridos se analizaron utilizando las bases de datos SwissProt y Trembl utilizando el software Proteinlynx global server 1.1 (Micromass). Los parámetros se establecieron en tolerancia a la masa del péptido de 100 mDa, oxidación de metionina y modificación de carboxiamidometil cisteína. El espectro de MS-MS de cada péptido emparejado se examinó individualmente, siendo los criterios de aceptación que las masas de iones originales y de fragmentos estaban dentro de los límites de tolerancia calibrados y que el espectro contenía una serie de al menos cuatro iones y'consecutivos. Preparación de muestras para mediciones de difusión de trazadores: para todas las mediciones de difusión de trazadores, microesferas fluorescentes de poliestireno (diámetro promedio 499 nm), preincubadas con albúmina de suero bovino (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002; 362: 289-296Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar), se mezclaron, 2% (p/v), con las muestras y se equilibraron durante la noche a 4 °C. Todas las mediciones confocales de FRAP en soluciones de saliva y MUC5B se realizaron en presencia de NaCl 0,1 M, pH 6,2-7,0 y a 25 °C, excepto en los experimentos sobre dependencia de la temperatura en los que las muestras se equilibraron durante 30 min a temperaturas de 15-52,5 °C. Para determinar la dependencia de la concentración de la difusión del trazador, la saliva se concentró inicialmente mediante diálisis contra el acueducto. Para las mediciones en presencia o ausencia de CaCl2 10 mm, la concentración de MUC5B en la saliva fue de hasta 0,1 mg/ml. En presencia de EGTA de 10 mm, la concentración de MUC5B fue de hasta 0,960 mg/ml. Las muestras de MUC5B purificadas en condiciones desnaturalizantes se diluyeron en NaCl 0.1 m, pH 6.5, y las mediciones se realizaron en soluciones de hasta 1.29 mg/ml. Para determinar los efectos de los cationes sobre la difusión del trazador, se añadieron las sales de cationes divalentes (CaCl2, MgCl2, MnCl2 y ZnCl2) o EGTA para proporcionar concentraciones finales de hasta 4 mm. Para evaluar la reversibilidad de los efectos, después de la adición de CaCl2, se añadió EGTA a una concentración equivalente al CaCl2 y se repitieron las mediciones confocales-FRAP. Para determinar el efecto del detergente sobre la difusión del trazador, se añadió Triton X-100 hasta 2% (v/v) a las soluciones de saliva. Las mediciones de difusión por recuperación de fluorescencia confocal-FRAP después de los experimentos de fotoblanqueo se llevaron a cabo utilizando un microscopio láser confocal (MRC-1000, Bio-Rad, Hemel Hempstead, Reino Unido) con un microscopio de epifluorescencia vertical (Optiphot 2, Nikon, Japón) (16Gribbon P. Hardingham T.E. Biophys. J. 1998; 75: 1032-1039Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (112) Google Scholar). Para los experimentos de difusión del trazador, se sellaron muestras de 10 μl que contenían microesferas de 499 nm bajo cubreobjetos de vidrio en un portaobjetos de microscopio plano. La técnica confocal-FRAP determina los coeficientes de difusión traslacional lateral, que se calcularon a partir de la dependencia temporal de las gráficas del segundo momento de la distribución promediada radialmente del fluoróforo blanqueado (16Gribbon P. Hardingham T.E. Biophys. J. 1998; 75: 1032-1039Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (112) Google Scholar, 17Gribbon P. Heng B.C. Hardingham T.E. Biophys. J. 1999; 77: 2210-2216Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (100) Google Scholar, 18Gribbon P. Heng B.C. Hardingham T.E. Biochem. J. 2000; 350: 329-335Crossref PubMed Scopus (72) Google Scholar, 21Kubitscheck U. Wedekind P. Peters R. Biophys. J. 1994; 67: 948-956Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (71) Google Scholar). Se realizaron cinco réplicas para cada experimento. En los experimentos de dependencia de la temperatura, la temperatura se controló utilizando un sistema de enfriamiento y calentamiento (PE-60, Linkam Instruments, Tadworth, Reino Unido) conectado al portaobjetos en el microscopio confocal. La dependencia de la concentración de los coeficientes de difusión traslacional del trazador en la saliva y MUC5B purificado se calculó utilizando la ecuación de escala para la difusión del trazador en redes poliméricas semidiluidas (20Phillies G.D.J. J. Phys. Chem. 1989; 93: 5029-5039 Crossref Scopus (171) Google Scholar) en la Ecuación 2, D= D0exp (-βcν)(Ec. 2) donde D es el coeficiente de difusión del trazador de traslación lateral aparente medido, D 0 es su coeficiente de difusión libre, y β y ν son constantes empíricas y están relacionadas con el tamaño de poro promedio de la red (19DeSmedt S.C. Lauwers A. Demeester J. Engelborghs Y. Demey G. Du M. Macromolecules. 1994; 27: 141-146 Crossref Scopus (74) Google Scholar) (Ecuación 3), que describe la distancia entre los puntos de entrelazamiento de la cadena (22De Gennes P.G. Scaling Concepts in Polymer Physics. Cornell University Press, Ithaca, NY1979Google Scholar) en la Ecuación 3. =-d/ln(D/D0)(Ec. 3) En esta ecuación d es el diámetro del trazador. Esto supone que el polímero forma una red regular de hebras unidas. Para los polímeros, como las soluciones de mucina, en los que las asociaciones entre cadenas son transitorias y la red formada sería dinámica, es una dimensión promedio que representa una distribución de tamaños de poro aparentes. En soluciones semidiluidas de polímeros, este análisis de la difusión del trazador, que da un tamaño de poro aparente, proporciona por lo tanto una medida combinada del enredo de la cadena, junto con cualquier efecto adicional de asociación intercadena específica. Unión al calcio: la unión del calcio a la fracción de mucina MUC5B de alta densidad purificada en condiciones suaves no desnaturalizantes se evaluó mediante cromatografía de exclusión por tamaño. A la fracción de mucina (500 μl a 50 μg/ml en NaCl 0.1 m, pH 6.5) se añadió 45CaCl2 (3.256 Ci/mmol) a una concentración final de 70 μm y se incubó durante la noche a temperatura ambiente. La muestra se cromatografió en una columna de Sepharose CL-2B (6 x 100 mm) eluida en NaCl 0,1 m, pH 6,5. Se recogieron fracciones (250 μl) y se midió la radiactividad mediante recuento de centelleo. También se determinó la unión de calcio (como anteriormente) después del tratamiento de la fracción de mucina de alta densidad con 6 m GdmCl. Una muestra de la mucina se dializó en 6 m GdmCl (pH 6.2) durante la noche a 4 °C y luego se volvió a introducir en 0.1 m NaCl, pH 6.5, antes de la adición de 45CaCl2 radiactivo. La fracción de mucina de alta densidad también se trató añadiendo DTT de 10 mm durante 30 min a 37 °C antes de la incubación con calcio radiactivo durante la noche a temperatura ambiente y cromatografía (como anteriormente). Para estimar la afinidad de la unión al calcio, se añadieron diferentes concentraciones de 45CaCl2 radiactivo (0.63 a 15.8 μm, 3.256 Ci/mmol) a 500 μl de la fracción de mucina de alta densidad (concentración de MUC5B 15 μg/ml en 0.1 m NaCl, pH 6.5). Las muestras se cromatografiaron en columnas de exclusión por tamaño PD-10 (Sephadex G-25) eluidas en NaCl 25 mm, Tris 20 mm, pH 7.0, y se midió la radiactividad en fracciones (500 μl) mediante recuento de centelleo. El trabajo previo que mide la difusión del trazador de microesferas de poliestireno fluorescentes mediante confocal-FRAP mostró que la mucina MUC5B salival purificada con GdmCl era mucho más permeable a la difusión del trazador que la saliva a concentraciones similares de mucina MUC5B (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002; 362: 289-296Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar). Por lo tanto, investigamos más a fondo las propiedades de la saliva para descubrir la base de esta diferencia en la organización molecular. La difusión del trazador en la saliva y la solución de MUC5B purificada con GdmCl mostró una reducción dependiente de la concentración en la difusión de las microesferas (499 nm de diámetro) (Fig. 1A). Esto siguió la forma general predicha para el entrelazamiento de polímeros de alto peso molecular (véase la Ecuación 2) (20Phillies G.D.J. J. Phys. Chem. 1989; 93: 5029-5039Crossref Scopus (171) Google Scholar). A partir de los resultados de la difusión del trazador, se calculó el cambio en el tamaño de poro aparente con la concentración (ver "Procedimientos experimentales", Ecuación 3) (Fig. 1B). Esto mostró que el tamaño de poro aparente en la solución de MUC5B purificada con GdmCl fue cuatro veces mayor que en la saliva, cuando se extrapoló a una concentración similar de MUC5B (100 μg/ml) cercana a la encontrada fisiológicamente. La diferencia no se debió a los efectos de la fuerza iónica, porque ambas preparaciones se analizaron en NaCl 0,1 m. Para comprender la base de la diferencia en el tamaño aparente de los poros, llevamos a cabo experimentos adicionales de difusión de trazadores en la saliva a concentraciones de MUC5B en el rango medio de la curva de dependencia de la concentración (45–55 μg/ml, Fig. 1A). A esta concentración, cualquier cambio en la difusión del trazador refleja, por lo tanto, cambios en la organización de las macromoléculas en la saliva que determinan la velocidad de difusión. Efecto del calcio y EGTA en la saliva: la adición de CaCl2, hasta 4 mm a la saliva en NaCl 0.1 m, causó una disminución importante en la difusión de las microesferas, que cayó de 5.6 × 10–9 a 1.8 × 10–9 cm2.s–1 (Fig. 1C). A partir de estas mediciones de difusión, el tamaño de poro aparente en la saliva (calculado a partir de la Ecuación 3, ver "Procedimientos experimentales") disminuyó de ~1200 a 300 nm después de la adición de CaCl2 de 4 mm (Fig. 1D). En un experimento similar a la misma concentración de saliva, la adición de EGTA aumentó la difusión del trazador (Fig. 1C), y a más de 3 mm de EGTA la difusión se igualó a la difusión libre. El resultado sugirió que EGTA estaba quelando calcio en la saliva y causando un aumento en la difusión del trazador. El tamaño de poro aparente calculado aumentó de ∼1200 a 7000 nm en presencia de EGTA de 2,5 mm (Fig. 1D). El tamaño de poro aparente de la saliva de las mediciones de difusión del trazador se incrementó así seis veces por EGTA. Estos cambios importantes en la difusión del trazador a una concentración constante de la saliva sugirieron que el calcio tiene un efecto importante en la organización de las macromoléculas en la saliva. La reversibilidad de este efecto se demostró mediante el análisis confocal-FRAP de una muestra tratada con EGTA y luego reequilibrada con calcio y reevaluada. La difusión del trazador aumentada por EGTA volvió a una tasa baja en presencia de calcio (resultados no mostrados). El efecto del calcio fue independiente del pH en el rango neutro pH 6–8 (resultados no mostrados). Los experimentos sugirieron que el calcio se unía fácilmente y se eliminaba de los sitios de interacción y que el cambio en la organización macromolecular en la saliva era libremente reversible. Se obtuvo una evaluación más completa de los efectos del calcio en la difusión del trazador en todo el rango de concentración de saliva (Fig. 1A). Hubo una reducción importante de la difusión del trazador en todo el rango de concentración en comparación con la saliva no tratada, con el efecto detectado a concentraciones muy bajas de MUC5B (5.5 μg/ml). Por el contrario, en presencia de EGTA, la saliva era mucho más permeable a la difusión del trazador, y los efectos sobre la difusión de las microesferas solo se detectaron por encima de 240 μg/ml (Fig. 1A). A partir de estos resultados, el tamaño de poro aparente mostró aproximadamente una diferencia de 20 veces entre la saliva tratada con EGTA y CaCl2 (Tabla I) cuando se comparó a una concentración fisiológica. Curiosamente, la difusión del trazador de las microesferas en la solución de mucina MUC5B purificada con GdmCl mostró una dependencia de la concentración similar a la de la saliva tratada con EGTA (Fig. 1A).Tabla Análisis de la difusión del trazadorConcentración críticaDifusión lateral D0 × 10-9Tamaño estimado () a 100 μg/ml de MUC5Bμg/mlcm2 s-1nmSaliva36.910.9620Saliva más 10 mm CaCl25.58.6130Saliva más 10 mm EGTA24012.92600GdmCl MUC5B32412.92710GdmCl MUC5B más 10 mm CaCl232013.22740 Abrir la tabla en una nueva pestaña Estas observaciones iniciales de los efectos del calcio en la difusión del trazador se investigaron más a fondo midiendo otras dos propiedades independientes. La viscosidad de la saliva fue similar a la determinada previamente por otros en condiciones iónicas similares (23Nordbo H. Darwish S. Bhatnagar R.S. J. DENT. Res. 1984; 92: 306-314Google Scholar, 24Veerman E.C.I. Valentijn-benz M. Nieuw Amerogen A.V. J. Biol. Buccale. 1989; 17: 297-306PubMed Google Scholar). Sin embargo, con la adición de CaCl2 de 10 mm, hubo un gran aumento en la viscosidad intrínseca (1033 a 1233 ml/g), y con EGTA de 10 mm hubo una gran disminución en la viscosidad intrínseca (1033 a 733 ml/g) (Fig. 2A y Tabla II). La presencia de calcio hizo que la saliva fuera más viscosa. El análisis de la saliva nativa mediante filtración en gel en S-1000 combinado con el análisis de MALLS mostró que contenía una fracción de alto peso molecular con un peso molecular promedio en peso aproximado de 28 × 106. En presencia de CaCl2 (10 mm), la distribución de peso molecular de la misma fracción de alto peso molecular mostró un aumento importante a ~62 × 106, y esto se redujo drásticamente a ~10 × 106 en presencia de EGTA (10 mm) (Fig. 2B y Tabla II). Por lo tanto, el calcio causó un aumento importante en (a) la viscosidad de la saliva y (b) el peso molecular promedio de los componentes de alto peso molecular en la saliva. Tabla IIViscosidad y distribución del peso molecular [η]Peso molecular promedio en pesoml ·g-1× 106Saliva103327.6Saliva más 10 mm CaCl2120361.8Saliva más 10 mm EGTA73310.1 La tabla abierta en una nueva pestaña Efecto de la fuerza iónica del solvente y los cationes divalentes (Mg2 + , Mn2 + y Zn2 + ) sobre la difusión del trazador en la saliva. El efecto del calcio sobre la difusión del trazador en la saliva no se vio afectado por la concentración de NaCl de 0.1 a 2 m (Fig. 3A). Por lo tanto, era poco probable que el efecto del calcio se debiera a una simple interacción electrostática entre las macromoléculas dentro de la saliva. Se investigaron los efectos de otros iones divalentes. Con la adición de MgCl2, MnCl2 y ZnCl2 hasta 4 mm no hubo cambios en la difusión del trazador (Fig. 3B). Los resultados mostraron que otros iones metálicos divalentes comunes no pueden sustituir a los iones de calcio y, por lo tanto, que el calcio tiene un efecto específico sobre la organización macromolecular en la saliva. Efecto de la temperatura en la difusión del trazador en la saliva: la difusión del trazador se determinó en la saliva equilibrada a diferentes temperaturas (15-52.5 ° C) (Fig. 3C). A medida que aumentó la temperatura, la difusión del trazador de las microesferas aumentó en un 20% en todo el rango de temperatura, cuando se corrigió el efecto de los cambios de viscosidad del disolvente en la difusión del trazador. El efecto fue reversible, ya que al enfriarse la difusión de las microesferas disminuyó y volvió al valor inicial. A partir del

The macromolecular organization within saliva was investigated by tracer diffusion measurements of fluorescent polystyrene microspheres by fluorescence recovery after photobleaching using a confocal microscope (confocal-FRAP). There was a concentration-dependent reduction in microsphere diffusion; this was much greater in the presence of calcium (10 mm) and was reduced by the addition of EGTA (10 mm). These effects on tracer diffusion showed that native saliva contained a macromolecular organization that was sensitive to free calcium concentrations. This was supported by a major increase in the weight average molecular weight of the high molecular weight mucin fraction in saliva (10–62 × 106) and an increase in intrinsic viscosity of saliva (733 to 1203 ml/g) both caused by calcium. Analysis of the change in tracer diffusion in saliva showed a 20-fold increase in the apparent pore size (from 130 nm in 10 mm CaCl2 to 2600 nm in 10 mm EGTA at physiological concentration). The effect was specific for calcium and was unaffected by up to 2 m NaCl. The calcium binding activity was contained in a high buoyant density fraction of saliva excluded from Sepharose CL-2B. Calcium binding to this fraction gave an approximate K d of 7 × 10–6m, and the binding was irreversibly destroyed by treatment with 6 m guanidinium chloride and by mild reduction, suggesting it to be to a protein site. This fraction of saliva was shown to contain MUC5B as the single major protein species by positive ion electrospray ionization-tandem mass spectrometry analysis. The results suggested that oligomeric MUC5B in saliva is assembled into much larger linear or branched assemblies through calcium-mediated protein cross-links. The macromolecular organization within saliva was investigated by tracer diffusion measurements of fluorescent polystyrene microspheres by fluorescence recovery after photobleaching using a confocal microscope (confocal-FRAP). There was a concentration-dependent reduction in microsphere diffusion; this was much greater in the presence of calcium (10 mm) and was reduced by the addition of EGTA (10 mm). These effects on tracer diffusion showed that native saliva contained a macromolecular organization that was sensitive to free calcium concentrations. This was supported by a major increase in the weight average molecular weight of the high molecular weight mucin fraction in saliva (10–62 × 106) and an increase in intrinsic viscosity of saliva (733 to 1203 ml/g) both caused by calcium. Analysis of the change in tracer diffusion in saliva showed a 20-fold increase in the apparent pore size (from 130 nm in 10 mm CaCl2 to 2600 nm in 10 mm EGTA at physiological concentration). The effect was specific for calcium and was unaffected by up to 2 m NaCl. The calcium binding activity was contained in a high buoyant density fraction of saliva excluded from Sepharose CL-2B. Calcium binding to this fraction gave an approximate K d of 7 × 10–6m, and the binding was irreversibly destroyed by treatment with 6 m guanidinium chloride and by mild reduction, suggesting it to be to a protein site. This fraction of saliva was shown to contain MUC5B as the single major protein species by positive ion electrospray ionization-tandem mass spectrometry analysis. The results suggested that oligomeric MUC5B in saliva is assembled into much larger linear or branched assemblies through calcium-mediated protein cross-links. Mucus forms a viscoelastic gel that coats the epithelial surfaces in humans and other vertebrates. The properties of the gel have been interpreted as being predominantly due to entanglement of the long, high molecular weight oligomeric mucins (1Carlstedt I. Sheehan J.K. Corfield A.P. Gallagher J.T. Essays Biochem. 1985; 20: 40-76PubMed Google Scholar, 2Verdugo P. Aitken M. Langley L. Villalon M.J. Biorheology. 1987; 24: 625-633Crossref PubMed Scopus (69) Google Scholar). Mucus has also been described as a network weakly cross-linked by non-covalent bonds (3Crowther R.S. Marriott C. James S.L. Biorheology. 1984; 21: 253-263Crossref PubMed Scopus (41) Google Scholar, 4Steiner C.A. Litt M. Nossal R. Biorheology. 1984; 21: 235-252Crossref PubMed Scopus (20) Google Scholar) and suggested mechanisms of interaction have included interchain hydrophobic interactions (5Bromberg L.E. Barr D.P. Biomacromolecules. 2000; 1: 325-334Crossref PubMed Scopus (62) Google Scholar) and carbohydrate-carbohydrate interactions between the mucins (6McCullagh C.M. Jamieson A.M. Blackwell J. Gupta R. Biopolymers. 1995; 35: 149-159Crossref PubMed Scopus (36) Google Scholar, 7Sellers L.A. Allen A. Morris E.R. Ross-Murphy S.B. Biochim. Biophys. Acta. 1991; 1115: 174-179Crossref PubMed Scopus (38) Google Scholar, 8Shogren R. Jamieson A.M. Blackwell J. Cheng P.W. Dearborn D.G. Boat T.F. Biopolymers. 1983; 22: 1657-1675Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar, 9Soby L.M. Jamieson A.M. Blackwell J. Jentoft N. Biopolymers. 1990; 29: 1359-1366Crossref PubMed Scopus (15) Google Scholar). Mucus rheology is affected by many factors, including hydration (2Verdugo P. Aitken M. Langley L. Villalon M.J. Biorheology. 1987; 24: 625-633Crossref PubMed Scopus (69) Google Scholar), pH (10Verdugo P. Annu. Rev. Physiol. 1990; 52: 157-176Crossref PubMed Scopus (243) Google Scholar), and ion content (11Glantz P.O. Wirth S.M. Baier R.E. Wirth J.E. Acta Odontol. Scand. 1989; 47: 7-15Crossref PubMed Scopus (14) Google Scholar, 12Saltzman W.M. Radomsky M.L. Whaley K.J. Cone R.A. Biophys. J. 1994; 66: 508-515Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (311) Google Scholar, 13Beeley J.A. Biochem. Soc. Trans. 1993; 21: 133-138Crossref PubMed Scopus (31) Google Scholar). Thus the supramolecular organization of the mucus layer is complex, and the molecular basis of this organization remains poorly defined. A layer of mucus coats the surfaces of the gastrointestinal, reproductive, and respiratory tracts as well as the eyes and oral cavity (14Madsen F. Eberth K. Smart J.D. J. Control Release. 1998; 50: 167-178Crossref PubMed Scopus (176) Google Scholar). This layer is the bodies' first line of defense against chemical, physical, and biological insult and a change in this barrier will compromise health. For example, in the airways overproduction of mucus with aberrant rheological properties is a feature of asthma, cystic fibrosis, and chronic obstructive pulmonary disease. In these situations the change in the physical properties of the barrier leads to a breakdown in mucus clearance from the airways with the attendant problems of poor gas exchange, bacterial colonization, and inflammation (10Verdugo P. Annu. Rev. Physiol. 1990; 52: 157-176Crossref PubMed Scopus (243) Google Scholar). To gain further insight into mucus organization we have recently employed diffusion analysis by fluorescence recovery after photobleaching using a confocal microscope (confocal-FRAP) 1The abbreviations used are: confocal-FRAP, fluorescence recovery after photobleaching using a confocal microscope; GdmCl, guanidinium chloride; DTT, dithiothreitol; ESI-MS-MS, positive ion electrospray ionization-tandem mass spectrometry; MALLS, multiangle laser light-scattering. to study the properties of saliva (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002; 362: 289-296Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar). This technique provides a powerful approach to investigate the properties of macromolecules in concentrated solution (16Gribbon P. Hardingham T.E. Biophys. J. 1998; 75: 1032-1039Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (112) Google Scholar). It enables molecular mobility to be determined in complex mixtures in the absence of flow and shear forces. In initial work we characterized the concentration dependence of the self-diffusion of the MUC5B mucin, the predominant oligomeric mucin present in saliva. The measurement of lateral translational diffusion of fluorescent microspheres of different size in solutions of purified MUC5B mucin and in native saliva was used to provide a direct estimate of the porosity (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002; 362: 289-296Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar, 17Gribbon P. Heng B.C. Hardingham T.E. Biophys. J. 1999; 77: 2210-2216Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (100) Google Scholar, 18Gribbon P. Heng B.C. Hardingham T.E. Biochem. J. 2000; 350: 329-335Crossref PubMed Scopus (72) Google Scholar, 19DeSmedt S.C. Lauwers A. Demeester J. Engelborghs Y. Demey G. Du M. Macromolecules. 1994; 27: 141-146Crossref Scopus (74) Google Scholar, 20Phillies G.D.J. J. Phys. Chem. 1989; 93: 5029-5039Crossref Scopus (171) Google Scholar). The results showed that purified MUC5B formed concentrated solutions in physiological saline in which there was no evidence of self-association, and the properties at high concentration were as predicted by molecular entanglement of the oligomeric mucins (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002; 362: 289-296Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar). Intermolecular hydrophobic interactions between mucins were not detected, neither were carbohydrate-carbohydrate interactions (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002; 362: 289-296Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar). However, comparison of native saliva with the solutions of guanidinium chloride (GdmCl) purified MUC5B under similar ionic conditions revealed that saliva had much lower porosity than the purified mucin at comparable concentrations, showing that saliva contained an additional level of organization that was absent from the purified MUC5B mucin (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002; 362: 289-296Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar). In the present study, we investigated the basis of the additional organization present in saliva, which reduced tracer diffusion. Materials—Trypsin, modified by reductive alkylation to reduce autolysis, was purchased from Promega (Southampton, UK). Acetonitrile (high performance liquid chromatography grade) was purchased from Rathburn Chemicals (Walkerburn, UK). Calcium chloride, urea, Tris, and sodium chloride were from BDH (Poole, UK). Guanidinium chloride (practical grade), EGTA, and iodoacetamide were purchased from Sigma Chemical Co. (Poole, UK). Stock solutions of guanidinium chloride (∼8 m) were treated with charcoal before use. The Pepmap column was from Dionex (Camberely, UK) and radioactive Calcium-45 (1 mCi), Sephacryl S-1000, Sepharose CL-2B, and PD-10 size exclusion columns (Sephadex G-25) were from Amersham Biosciences (UK). Dithiothreitol (DTT) was from Melford Laboratories (Ipswich, UK), and cesium chloride was from Q-Biogene (Alexis Ltd., Nottingham, UK). Saliva Collection and Determination of MUC5B Concentration— Fresh whole human saliva was collected from 5–10 healthy donors and centrifuged at 2700 × g for 30 min at 4 °C to remove particulate matter. The preparation was homogenous with a pH of 6.2–7.0. It was stored at 4 °C and was used within 5 days and showed no significant change in pH or properties over this time. MUC5B mucin concentration was determined by refractive index measurements as described previously (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002; 362: 289-296Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar). Viscosity and Molecular Weight Determination—Three aliquots of saliva (15 ml) were dialyzed separately against: buffer A, 0.1 m NaCl, 20 mm Tris, pH 7.0; buffer B, the same buffer with 10 mm EGTA; or buffer C, the same buffer with 10 mm CaCl2. The dialysate of each sample was kept as control buffer. For molecular weight determination, the dialyzed samples were chromatographed on a Sephacryl S-1000 column (300 × 10 mm) eluted with their respective buffer (buffers A–C) at a flow rate of 12 ml/h. The mass average molecular mass was determined using an in-line multiangle laser light-scattering (MALLS) photometer and a differential refractometer (Dawn DSP, Wyatt Technology, Santa Barbara, CA). For each sample, analysis of the weight average molecular weight was carried out by integrating the major high molecular weight mucin peak between 6 and 15 ml of elution volume with a refractive increment (dn/dc) of 0.160 ml/g. Viscosity determinations were carried out in an Ostwald capillary viscometer at a constant temperature of 25 °C. Samples were diluted in their respective buffers (A–C) to give concentration between 29 and 204 μg/ml. For each sample, the flow time in the viscometer was measured five times and averaged. Intrinsicviscosity[η]=limc→0ηspecc=limc→0t-t0t0c(Eq. 1) Where t and t 0 are sample and buffer flow times, respectively, and c is the MUC5B mucin concentration. The intrinsic viscosity [η] was measured by plotting the reduced viscosity as a function of mucin concentration (Huggins plot). From Equation 1 the fitted straight line at zero concentration gave the intrinsic viscosity. Straight line correlations were all above 0.98. MUC5B Mucin Preparation from Saliva under Denaturing Conditions—MUC5B mucins were purified from saliva, by established methods (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002; 362: 289-296Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar). Saliva was initially equilibrated in 6 m GdmCl and fractionated by size exclusion chromatography and two-step density-gradient centrifugation in 4 m GdmCl. This preparation was dialyzed into relevant ionic solutions prior to measurements. Mucin Preparation from Saliva under Non-denaturing Conditions— Fresh saliva was gently stirred overnight at 4 °C with an equal volume of 0.2 m NaCl. The pH was 6.2–7.0. After centrifugation (4400 × g, 30 min, 4 °C), the supernatant was fractionated by equilibrium density-gradient centrifugation (starting density, 1.45 mg/ml) in CsCl/0.1 m NaCl, pH 6.5, in a Beckman Ti45 rotor at 40,000 rpm for 65 h at 15 °C. The high density fractions containing MUC5B mucin were pooled, dialyzed against 0.1 m NaCl, pH 6.5, and stored at 4 °C after the addition of 0.05% (w/v) sodium azide. A 25-ml fraction of this preparation was chromatographed on a size exclusion column (1000 × x 52 mm, Sepharose CL-2B) eluted in 0.1 m NaCl, 10 mm EGTA, pH 8.0, at a flow rate of 24 ml/h. MUC5B mucin fractions, in the void volume of the column, were pooled and dialyzed against 0.1 m NaCl, pH 6.5, and part was concentrated against polyethylene glycol (5% w/v) and tested for calcium-dependent effects on tracer diffusion by confocal-FRAP. Protein Identification by Mass Spectrometry—An aliquot of the high density MUC5B mucin-containing fraction purified by CsCl density gradient under non-denaturing conditions (see above) was reduced (10 mm DTT for 2 h) and alkylated (25 mm iodoacetamide for 30 min in the dark) and then dialyzed against water and lyophilized. In addition, a 5-ml aliquot of the pooled high density MUC5B mucin-containing fraction was chromatographed on a size exclusion column (600 × 10 mm, Sepharose CL-2B) eluted in 0.1 m NaCl, pH 6.5, containing 10 mm CaCl2 at a flow rate of 60 ml/h. The void volume fraction was reduced and alkylated as described above. Both preparations were digested overnight at 37 °C with 1 μg of trypsin per 10 μg of protein in 100 mm ammonium bicarbonate pH 8.0. Tryptic peptides were separated by reverse-phase chromatography and analyzed in-line by positive ion ESI-MS-MS using a Q-ToF micro mass spectrometer (Micromass, Manchester, UK). Samples were introduced via a capillary liquid chromatography system fitted with a stream select module (Micromass). Aliquots (10–50 μl) of the samples were separated on a Pepmap column (0.075 × 150 mm) with a gradient of 5% acetonitrile in 0.1% formic acid to 25% acetonitrile in 0.1% formic acid over 30 min at a flow rate of 200 nl/min. This process was repeated twice for each sample, and peptides identified in the first run were excluded from the second analysis. Data acquired were analyzed using SwissProt and Trembl databases using the Proteinlynx global server 1.1 software (Micromass). Parameters were set to 100-mDa peptide mass tolerance, methionine oxidation and carboxyamidomethyl cysteine modification. The MS-MS spectrum of each peptide matched was examined individually with the acceptance criteria being that the parent and fragment ion masses were within the calibrated tolerance limits and that the spectrum contained a series of at least four consecutive y′ ions. Preparation of Samples for Tracer Diffusion Measurements—For all tracer diffusion measurements, fluorescent polystyrene microspheres (average diameter 499 nm), preincubated with bovine serum albumin (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002; 362: 289-296Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar), were mixed, 2% (w/v), with the samples, and equilibrated overnight at 4 °C. All confocal-FRAP measurements on saliva and MUC5B solutions were performed in the presence of 0.1 m NaCl, pH 6.2–7.0 and at 25 °C, except in the experiments on temperature dependence in which samples were equilibrated for 30 min at temperatures from 15–52.5 °C. For determining the concentration dependence of tracer diffusion, saliva was initially concentrated by dialysis against aquacide. For measurements in the presence or absence of 10 mm CaCl2, the concentration of MUC5B in the saliva was up to 0.1 mg/ml. In the presence of 10 mm EGTA the concentration of MUC5B was up to 0.960 mg/ml. MUC5B samples purified under denaturing conditions were diluted in 0.1 m NaCl, pH 6.5, and measurements were made on solutions up to 1.29 mg/ml. To determine the effects of cations on tracer diffusion the salts of divalent cations (CaCl2, MgCl2, MnCl2, and ZnCl2) or EGTA were added to give final concentrations up to 4 mm. To assess the reversibility of the effects, after the addition of CaCl2, EGTA was added to a concentration equivalent to the CaCl2 and the confocal-FRAP measurements were repeated. To determine the effect of detergent on tracer diffusion, Triton X-100 up to 2% (v/v) was added to saliva solutions. Diffusion Measurements by Confocal-FRAP—Fluorescence recovery after photobleaching experiments were carried out using a confocal laser microscope (MRC-1000, Bio-Rad, Hemel Hempstead, UK) with an upright epifluorescence microscope (Optiphot 2, Nikon, Japan) (16Gribbon P. Hardingham T.E. Biophys. J. 1998; 75: 1032-1039Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (112) Google Scholar). For tracer diffusion experiments, 10-μl samples containing 499-nm microspheres were sealed under glass coverslips on a flat microscope slide. The confocal-FRAP technique determines the lateral translational diffusion coefficients, which were calculated from the time dependence of the plots of the second moment of the radially averaged distribution of bleached fluorophore (16Gribbon P. Hardingham T.E. Biophys. J. 1998; 75: 1032-1039Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (112) Google Scholar, 17Gribbon P. Heng B.C. Hardingham T.E. Biophys. J. 1999; 77: 2210-2216Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (100) Google Scholar, 18Gribbon P. Heng B.C. Hardingham T.E. Biochem. J. 2000; 350: 329-335Crossref PubMed Scopus (72) Google Scholar, 21Kubitscheck U. Wedekind P. Peters R. Biophys. J. 1994; 67: 948-956Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (71) Google Scholar). Five replicates were performed for each experiment. In the temperature dependence experiments the temperature was controlled using a cooling and heating system (PE-60, Linkam Instruments, Tadworth, UK) attached to the slide holder on the confocal microscope. The concentration dependence of translational diffusion coefficients of the tracer in saliva and purified MUC5B was calculated using the scaling equation for tracer diffusion in semi-dilute polymer networks (20Phillies G.D.J. J. Phys. Chem. 1989; 93: 5029-5039Crossref Scopus (171) Google Scholar) in Equation 2, D=D0exp(-βcν)(Eq. 2) where D is the measured apparent lateral translational tracer diffusion coefficient, D 0 is its free diffusion coefficient, and β and ν are empirical constants and are related to the average pore size of the network ξ (19DeSmedt S.C. Lauwers A. Demeester J. Engelborghs Y. Demey G. Du M. Macromolecules. 1994; 27: 141-146Crossref Scopus (74) Google Scholar) (Equation 3), which describes the distance between chain entanglement points (22De Gennes P.G. Scaling Concepts in Polymer Physics. Cornell University Press, Ithaca, NY1979Google Scholar) in Equation 3. ξ=-d/ln(D/D0)(Eq. 3) In this equation d is the diameter of the tracer. This assumes that the polymer forms a regular network of linked strands. For polymers, such as mucin solutions, in which interchain associations are transient and the network formed would be dynamic, ξ is an average dimension representing a distribution of apparent pore sizes. In semi-dilute solutions of polymers, this analysis of tracer diffusion, which gives an apparent pore size, therefore provides a combined measure of chain entanglement, together with any additional effect of specific interchain association. Calcium Binding—Calcium binding to the high density MUC5B mucin fraction purified under mild non-denaturing conditions was assessed by size exclusion chromatography. To the mucin fraction (500 μl at 50 μg/ml in 0.1 m NaCl, pH 6.5) 45CaCl2 (3.256 Ci/mmol) was added to a final concentration of 70 μm and incubated overnight at room temperature. The sample was chromatographed on a column of Sepharose CL-2B (6 × 100 mm) eluted in 0.1 m NaCl, pH 6.5. Fractions (250 μl) were collected, and the radioactivity was measured by scintillation counting. Calcium binding was also determined (as above) after treatment of the high density mucin fraction with 6 m GdmCl. A sample of the mucin was dialyzed into 6 m GdmCl (pH 6.2) overnight at 4 °C and then back into 0.1 m NaCl, pH 6.5, prior to addition of radioactive 45CaCl2. The high density mucin fraction was also treated by adding 10 mm DTT for 30 min at 37 °C prior to incubation with radioactive calcium overnight at room temperature and chromatography (as above). To estimate the affinity of calcium binding different concentrations of radioactive 45CaCl2 (0.63 to 15.8 μm, 3.256 Ci/mmol) were added to 500 μl of the high density mucin fraction (MUC5B concentration 15 μg/ml in 0.1 m NaCl, pH 6.5). The samples were chromatographed on PD-10 size exclusion columns (Sephadex G-25) eluted in 25 mm NaCl, 20 mm Tris, pH 7.0, and the radioactivity in fractions (500 μl) was measured by scintillation counting. Previous work measuring tracer diffusion of fluorescent polystyrene microspheres by confocal-FRAP showed that GdmCl-purified salivary MUC5B mucin was much more permeable to tracer diffusion than saliva at similar concentrations of MUC5B mucin (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002; 362: 289-296Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar). We therefore investigated the properties of saliva further to discover the basis for this difference in molecular organization. Tracer diffusion in saliva and GdmCl-purified MUC5B solution showed a concentration-dependent reduction in diffusion of microspheres (499-nm diameter) (Fig. 1A). This followed the general form predicted for entanglement of high molecular weight polymers (see Equation 2) (20Phillies G.D.J. J. Phys. Chem. 1989; 93: 5029-5039Crossref Scopus (171) Google Scholar). From the results of tracer diffusion the change in apparent pore size with concentration was calculated (see "Experimental Procedures," Equation 3) (Fig. 1B). This showed that the apparent pore size in GdmCl-purified MUC5B solution was four times larger than in saliva, when extrapolated to similar MUC5B concentration (100 μg/ml) close to that found physiologically. The difference was not due to ionic strength effects, because both preparations were analyzed in 0.1 m NaCl. To understand the basis for the difference in apparent pore size, we carried out further tracer diffusion experiments on saliva at concentrations of MUC5B in the mid-range of the concentration-dependence curve (45–55 μg/ml, Fig. 1A). At this concentration any change in tracer diffusion therefore reflects changes in the organization of the macromolecules in saliva that determine the rate of diffusion. Effect of Calcium and EGTA on Saliva—The addition of CaCl2, up to 4 mm to saliva in 0.1 m NaCl, caused a major decrease in the diffusion of the microspheres, which fell from 5.6 × 10–9 to 1.8 × 10–9 cm2.s–1 (Fig. 1C). From these diffusion measurements, the apparent pore size in saliva (calculated from Equation 3, see "Experimental Procedures") decreased from ∼1200 to 300 nm after addition of 4 mm CaCl2 (Fig. 1D). In a similar experiment at the same saliva concentration, adding EGTA increased tracer diffusion (Fig. 1C), and at over 3 mm EGTA the diffusion became equal to the free diffusion. The result suggested that EGTA was chelating calcium in saliva and causing an increase in tracer diffusion. The calculated apparent pore size increased from ∼1200 to 7000 nm in the presence of 2.5 mm EGTA (Fig. 1D). The apparent pore size of saliva from tracer diffusion measurements was thus increased six times by EGTA. These major changes in tracer diffusion at a constant concentration of the saliva suggested that calcium has a major effect on the organization of the macromolecules in saliva. The reversibility of this effect was shown by confocal-FRAP analysis of a sample treated with EGTA and then reequilibrated with calcium and re-tested. The tracer diffusion increased by EGTA returned to a low rate in the presence of calcium (results not shown). The calcium effect was independent of pH in the neutral range pH 6–8 (results not shown). The experiments suggested that calcium was easily bound and removed from sites of interaction and that the change in macromolecular organization in saliva was freely reversible. A more complete assessment of the effects of calcium on tracer diffusion over the full range of saliva concentration was obtained (Fig. 1A). There was a major reduction of tracer diffusion throughout the concentration range compared with untreated saliva, with the effect detected at very low concentrations of MUC5B (5.5 μg/ml). In contrast, in the presence of EGTA, the saliva was much more permeable to tracer diffusion, and effects on microsphere diffusion were only detected above 240 μg/ml (Fig. 1A). From these results the apparent pore size showed approximately a 20-fold difference between EGTA- and CaCl2-treated saliva (Table I) when compared at a physiological concentration. Interestingly, the tracer diffusion of the microspheres in GdmCl-purified MUC5B mucin solution showed a similar concentration dependence as in saliva treated with EGTA (Fig. 1A).Table IAnalysis of tracer diffusionCritical concentrationLateral diffusion D0 × 10-9Estimated size (ξ) at 100 μg/ml of MUC5Bμg/mlcm2 s-1nmSaliva36.910.9620Saliva plus 10 mm CaCl25.58.6130Saliva plus 10 mm EGTA24012.92600GdmCl MUC5B32412.92710GdmCl MUC5B plus 10 mm CaCl232013.22740 Open table in a new tab These initial observations of calcium effects on tracer diffusion were investigated further by measuring two other independent properties. The viscosity of saliva was similar to that previously determined by others under similar ionic conditions (23Nordbo H. Darwish S. Bhatnagar R.S. J. DENT. Res. 1984; 92: 306-314Google Scholar, 24Veerman E.C.I. Valentijn-benz M. Nieuw Amerogen A.V. J. Biol. Buccale. 1989; 17: 297-306PubMed Google Scholar). However, with the addition of 10 mm CaCl2, there was a large increase in intrinsic viscosity (1033 to 1233 ml/g), and with 10 mm EGTA there was a large decrease in intrinsic viscosity (1033 to 733 ml/g) (Fig. 2A and Table II). The presence of calcium thus caused the saliva to be more viscous. Analysis of native saliva by gel filtration on S-1000 combined with MALLS analysis showed it to contain a high molecular weight fraction with an approximate weight average molecular weight of 28 × 106. In the presence of CaCl2 (10 mm) the molecular weight distribution of the same high molecular weight fraction showed a major increase to ∼62 × 106, and this was reduced dramatically to ∼10 × 106 in the presence of EGTA (10 mm) (Fig. 2B and Table II). Calcium thus caused a major increase in (a) the viscosity of saliva and (b) the average molecular weight of the high molecular weight components in saliva.Table IIViscosity and molecular weight distribution[η]Weight average molecular weightml·g-1× 106Saliva103327.6Saliva plus 10 mm CaCl2120361.8Saliva plus 10 mm EGTA73310.1 Open table in a new tab Effect of Solvent Ionic Strength and Divalent Cations (Mg2 + , Mn2 + , and Zn2 + ) on Tracer Diffusion in Saliva—The effect of calcium on tracer diffusion in saliva was unaffected by NaCl concentration 0.1 to 2 m (Fig. 3A). The calcium effect was thus unlikely to be due to simple electrostatic interaction among the macromolecules within saliva. The effects of other divalent ions were investigated. With addition of MgCl2, MnCl2, and ZnCl2 up to 4 mm there was no change in tracer diffusion (Fig. 3B). The results showed that other common divalent metal ions cannot substitute for calcium ions and therefore that calcium has a specific effect on macromolecular organization in saliva. Effect of Temperature on Tracer Diffusion in Saliva—Tracer diffusion was determined on saliva equilibrated at different temperature (15–52.5 °C) (Fig. 3C). As the temperature increased the tracer diffusion of the microspheres increased by 20% over the full range of temperature, when corrected for the effect of viscosity changes of the solvent on tracer diffusion. The effect was reversible, because on cooling the diffusion of the microspheres decreased and returned to the initial value. From th

تم فحص التنظيم الجزيئي الكبير داخل اللعاب من خلال قياسات انتشار التتبع للكريات الدقيقة من البوليسترين الفلورسنت عن طريق استعادة الفلورة بعد التبييض الضوئي باستخدام مجهر متحد البؤر (confocal - FRAP). كان هناك انخفاض يعتمد على التركيز في انتشار الكرات الدقيقة ؛ كان هذا أكبر بكثير في وجود الكالسيوم (10 مم) وتم تقليله عن طريق إضافة EGTA (10 مم). أظهرت هذه التأثيرات على انتشار التتبع أن اللعاب الأصلي يحتوي على تنظيم جزيئي كبير حساس لتركيزات الكالسيوم الحرة. وقد دعم ذلك زيادة كبيرة في متوسط الوزن الجزيئي لجزء الميوسين عالي الوزن الجزيئي في اللعاب (10-62 × 106) وزيادة في اللزوجة الجوهرية للعاب (733 إلى 1203 مل/جم) بسبب الكالسيوم. أظهر تحليل التغير في انتشار مادة التتبع في اللعاب زيادة قدرها 20 ضعفًا في حجم المسام الظاهر (من 130 نانومتر في 10 مم CaCl2 إلى 2600 نانومتر في 10 مم EGTA عند التركيز الفسيولوجي). كان التأثير محددًا للكالسيوم ولم يتأثر بما يصل إلى 2 متر من كلوريد الصوديوم. تم احتواء نشاط ربط الكالسيوم في جزء عالي الكثافة من اللعاب المستبعد من سيفاروز CL -2B. أعطى ربط الكالسيوم بهذا الجزء حوالي 7 × 10-6 م، وتم تدمير الربط بشكل لا رجعة فيه عن طريق العلاج باستخدام كلوريد الغوانيدينيوم 6 م وعن طريق الرد الطفيف، مما يشير إلى أنه إلى موقع بروتين. وقد تبين أن هذا الجزء من اللعاب يحتوي على MUC5B كنوع بروتين رئيسي واحد عن طريق التأين الكهربائي الأيوني الإيجابي - تحليل الطيف الكتلي الترادفي. أشارت النتائج إلى أن MUC5B القليلي في اللعاب يتم تجميعه في تجمعات خطية أو متفرعة أكبر بكثير من خلال روابط متقاطعة من البروتين بوساطة الكالسيوم. تم فحص التنظيم الجزيئي الكبير داخل اللعاب من خلال قياسات انتشار التتبع للكريات الدقيقة من البوليسترين الفلورسنت عن طريق استعادة الفلورة بعد التبييض الضوئي باستخدام مجهر متحد البؤر (confocal - FRAP). كان هناك انخفاض يعتمد على التركيز في انتشار الكرات الدقيقة ؛ كان هذا أكبر بكثير في وجود الكالسيوم (10 مم) وتم تقليله عن طريق إضافة EGTA (10 مم). أظهرت هذه التأثيرات على انتشار التتبع أن اللعاب الأصلي يحتوي على تنظيم جزيئي كبير حساس لتركيزات الكالسيوم الحرة. وقد دعم ذلك زيادة كبيرة في متوسط الوزن الجزيئي لجزء الميوسين عالي الوزن الجزيئي في اللعاب (10-62 × 106) وزيادة في اللزوجة الجوهرية للعاب (733 إلى 1203 مل/جم) بسبب الكالسيوم. أظهر تحليل التغير في انتشار مادة التتبع في اللعاب زيادة قدرها 20 ضعفًا في حجم المسام الظاهر (من 130 نانومتر في 10 مم CaCl2 إلى 2600 نانومتر في 10 مم EGTA عند التركيز الفسيولوجي). كان التأثير محددًا للكالسيوم ولم يتأثر بما يصل إلى 2 متر من كلوريد الصوديوم. تم احتواء نشاط ربط الكالسيوم في جزء عالي الكثافة من اللعاب المستبعد من سيفاروز CL -2B. أعطى ربط الكالسيوم بهذا الجزء حوالي 7 × 10-6 م، وتم تدمير الربط بشكل لا رجعة فيه عن طريق العلاج باستخدام كلوريد الغوانيدينيوم 6 م وعن طريق الرد الطفيف، مما يشير إلى أنه إلى موقع بروتين. وقد تبين أن هذا الجزء من اللعاب يحتوي على MUC5B كنوع بروتين رئيسي واحد عن طريق التأين الكهربائي الأيوني الإيجابي - تحليل الطيف الكتلي الترادفي. أشارت النتائج إلى أن MUC5B القليلي في اللعاب يتم تجميعه في تجمعات خطية أو متفرعة أكبر بكثير من خلال روابط متقاطعة من البروتين بوساطة الكالسيوم. يشكل المخاط جلًا لزجًا مرنًا يغطي الأسطح الظهارية لدى البشر والفقاريات الأخرى. تم تفسير خصائص الهلام على أنها في الغالب بسبب تشابك المخاطين الأوليغومرية طويلة وعالية الوزن الجزيئي (1Carlstedt I. Sheehan JK Corfield A.P. Gallagher J.T. Essays Biochem. 1985 ؛ 20: 40-76 PubMed Google Scholar، 2Verdugo P. Aitken M. Langley L. Villalon M.J. Biiorheology. 1987 ؛ 24: 625-633 Crossref PubMed Scopus (69) الباحث العلمي من Google). كما تم وصف المخاط بأنه شبكة ضعيفة الارتباط بالسندات غير التساهمية (3Crowther R.S. Marriott C. James S.L. Biorheology. 1984 ؛ 21: 253-263 Crossref PubMed Scopus (41) Google Scholar، 4Steiner C.A. Litt M. Nossal R. Biorheology. 1984 ؛ 21: 235-252 كروسريف بوبمد سكوبس (20) باحث جوجل) وآليات التفاعل المقترحة شملت التفاعلات الكارهة للماء بين السلاسل (5 برومبرج إل إي بار دي بي الجزيئات الحيوية. 2000 ؛ 1: 325-334 Crossref PubMed Scopus (62) Google Scholar) وتفاعلات الكربوهيدرات والكربوهيدرات بين المخاطين (6McCullagh C.M. Jamieson AM Blackwell J. Gupta R. Biopolymers. 1995 ؛ 35: 149-159 Crossref PubMed Scopus (36) Google Scholar، 7Sellers LA Allen A. Morris E.R. Ross - Murphy S.B. Biochim. بيوفيس. اكتا. 1991 ؛ 1115: 174-179 كروسريف بوبمد سكوبس (38) باحث جوجل، 8 شوغرن ر. جاميسون صباحا بلاكويل ج. تشنغ بو ديربورن دغ قارب TF البوليمرات الحيوية. 1983 ؛ 22: 1657-1675 Crossref PubMed Scopus (26) Google Scholar، 9Soby L.M. Jamieson AM Blackwell J. Jentoft N. Biopolymers. 1990 ؛ 29: 1359-1366 Crossref PubMed Scopus (15) الباحث العلمي من Google). تتأثر انسيابية المخاط بالعديد من العوامل، بما في ذلك الترطيب (2Verdugo P. Aitken M. Langley L. Villalon M.J. Biiorheology. 1987 ؛ 24: 625-633 Crossref PubMed Scopus (69) Google Scholar)، درجة الحموضة (10Verdugo P. Annu. Rev. Physiol. 1990; 52: 157-176 Crossref PubMed Scopus (243) Google Scholar)، والمحتوى الأيوني (11Glantz P.O. Wirth S.M. Baier R.E. Wirth J.E. Acta Odontol. SCAND. 1989 ؛ 47: 7-15 Crossref PubMed Scopus (14) Google Scholar، 12Saltzman WM Radomsky M.L. Whaley K.J. Cone R.A. Biophys. J. 1994 ؛ 66: 508-515 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (311) باحث جوجل، 13Beeley JA Biochem. Soc. Trans. 1993 ؛ 21: 133-138 Crossref PubMed Scopus (31) الباحث العلمي من Google). وبالتالي فإن التنظيم فوق الجزيئي للطبقة المخاطية معقد، ولا يزال الأساس الجزيئي لهذا التنظيم غير محدد بشكل جيد. طبقة من المخاط تغطي أسطح الجهاز الهضمي والتناسلي والجهاز التنفسي وكذلك العينين وتجويف الفم (14Madsen F. Eberth K. Smart JDJ Control Release. 1998 ؛ 50: 167-178 Crossref PubMed Scopus (176) الباحث العلمي من Google). هذه الطبقة هي خط الدفاع الأول للأجسام ضد الإهانة الكيميائية والفيزيائية والبيولوجية، والتغيير في هذا الحاجز سيضر بالصحة. على سبيل المثال، في الممرات الهوائية، يعد الإفراط في إنتاج المخاط ذو الخصائص الريولوجية الشاذة سمة من سمات الربو والتليف الكيسي ومرض الانسداد الرئوي المزمن. في هذه الحالات، يؤدي التغيير في الخصائص الفيزيائية للحاجز إلى انهيار في إزالة المخاط من الشعب الهوائية مع ما يصاحب ذلك من مشاكل سوء تبادل الغازات والاستعمار البكتيري والالتهاب (10Verdugo P. Annu. القس فيزيول. 1990 ؛ 52: 157-176 Crossref PubMed Scopus (243) باحث جوجل). للحصول على مزيد من التبصر في تنظيم المخاط، استخدمنا مؤخرًا تحليل الانتشار عن طريق استعادة الفلورة بعد التبييض الضوئي باستخدام مجهر متحد البؤر (متحد البؤر- FRAP) 1 الاختصارات المستخدمة هي: متحد البؤر- FRAP، استعادة الفلورة بعد التبييض الضوئي باستخدام مجهر متحد البؤر ؛ GdmCl، كلوريد الغوانيدينيوم ؛ DTT، dithiothreitol ؛ ESI - MS - MS، التأين الكهربائي الأيوني الإيجابي - قياس الطيف الكتلي الترادفي ؛ مراكز التسوق، تشتت الضوء بالليزر متعدد الزوايا. لدراسة خصائص اللعاب (15Raynal BD Hardingham TE Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002 ؛ 362: 289-296 Crossref PubMed Scopus (70) الباحث العلمي من Google). توفر هذه التقنية نهجًا قويًا للتحقيق في خصائص الجزيئات الكبيرة في المحلول المركز (16Gribbon P. Hardingham TE Biophys. J. 1998; 75: 1032-1039 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (112) Google Scholar). إنه يمكّن من تحديد الحركة الجزيئية في مخاليط معقدة في غياب قوى التدفق والقص. في العمل الأولي، ميزنا الاعتماد على تركيز الانتشار الذاتي لميوسين MUC5B، وهو الميوسين الأوليغوميري السائد الموجود في اللعاب. تم استخدام قياس الانتشار الانتقالي الجانبي للكريات الدقيقة الفلورية ذات الحجم المختلف في محاليل ميوسين MUC5B المنقى وفي اللعاب الأصلي لتوفير تقدير مباشر للمسامية (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002; 362: 289-296 Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar, 17Gribbon P. Heng B.C. Hardingham T.E. Biophys. ي. 1999 ؛ 77: 2210-2216 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (100) الباحث العلمي من Google، 18Gribbon P. Heng B.C. Hardingham T.E. Biochem. J. 2000; 350: 329-335 Crossref PubMed Scopus (72) Google Scholar, 19DeSmedt S.C. Lauwers A. Demeester J. Engelborghs Y. Demey G. Du M. Macromolecules. 1994 ؛ 27: 141-146 كروسريف سكوبس (74) باحث جوجل، 20Phillies GDJJ Phys. الكيمياء. 1989 ؛ 93: 5029-5039 Crossref Scopus (171) الباحث العلمي من Google). أظهرت النتائج أن MUC5B المنقى شكل محاليل مركزة في محلول ملحي فيزيولوجي لا يوجد فيه دليل على الارتباط الذاتي، وكانت الخصائص عند التركيز العالي كما تنبأ بها التشابك الجزيئي لميوسينات الأوليغوميرات (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002 ؛ 362: 289-296 Crossref PubMed Scopus (70) الباحث العلمي من Google). لم يتم الكشف عن التفاعلات الكارهة للماء بين الجزيئات بين المخاطين، كما لم يتم الكشف عن تفاعلات الكربوهيدرات والكربوهيدرات (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002 ؛ 362: 289-296 Crossref PubMed Scopus (70) الباحث العلمي من Google). ومع ذلك، كشفت مقارنة اللعاب الأصلي مع محاليل كلوريد الغوانيدينيوم (GdmCl) المنقى MUC5B في ظل ظروف أيونية مماثلة أن اللعاب له مسامية أقل بكثير من الموسين المنقى بتركيزات مماثلة، مما يدل على أن اللعاب يحتوي على مستوى إضافي من التنظيم الذي كان غائبًا عن موسين MUC5B المنقى (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002 ؛ 362: 289-296 Crossref PubMed Scopus (70) الباحث العلمي من Google). في هذه الدراسة، قمنا بالتحقيق في أساس التنظيم الإضافي الموجود في اللعاب، مما قلل من انتشار التتبع. المواد - تم شراء التريبسين، المعدل بالألكلة المختزلة لتقليل التحلل الذاتي، من بروميغا (ساوثهامبتون، المملكة المتحدة). تم شراء الأسيتونيتريل (درجة كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء) من Rathburn Chemicals (Walkerburn، المملكة المتحدة). كان كلوريد الكالسيوم واليوريا وتريس وكلوريد الصوديوم من BDH (بول، المملكة المتحدة). تم شراء كلوريد الجوانيدينيوم (الدرجة العملية)، EGTA، و iodoacetamide من شركة سيجما للكيماويات (بول، المملكة المتحدة). تمت معالجة محاليل مخزون كلوريد الغوانيدينيوم (8 م) بالفحم قبل الاستخدام. كان عمود Pepmap من Dionex (Camberely، المملكة المتحدة) وكان الكالسيوم المشع 45 (1 mCi)، Sephacryl S -1000، Sepharose CL -2B، وأعمدة استبعاد حجم PD -10 (Sephadex G -25) من Amersham Biosciences (المملكة المتحدة). كان ديثيوثريتول (دي تي تي) من مختبرات ميلفورد (إبسويتش، المملكة المتحدة)، وكان كلوريد السيزيوم من كيو- بيوجين (أليكسيس المحدودة، نوتنغهام، المملكة المتحدة). جمع اللعاب وتحديد تركيز MUC5B - تم جمع اللعاب البشري الكامل الطازج من 5–10 متبرعين أصحاء وطرده مركزيًا عند 2700 × جم لمدة 30 دقيقة عند 4 درجات مئوية لإزالة الجسيمات. كان التحضير متجانسًا مع درجة حموضة 6.2–7.0. تم تخزينه عند 4 درجات مئوية وتم استخدامه في غضون 5 أيام ولم يظهر أي تغيير كبير في درجة الحموضة أو الخصائص خلال هذا الوقت. تم تحديد تركيز الميوسين MUC5B من خلال قياسات مؤشر الانكسار كما هو موضح سابقًا (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002 ؛ 362: 289-296 Crossref PubMed Scopus (70) الباحث العلمي من Google). اللزوجة وتحديد الوزن الجزيئي - تم تحليل ثلاثة ألياف من اللعاب (15 مل) بشكل منفصل مقابل: العازلة A، 0.1 م كلوريد الصوديوم، 20 مم تريس، الرقم الهيدروجيني 7.0 ؛ العازلة B، نفس العازلة مع 10 مم EGTA ؛ أو العازلة C، نفس العازلة مع 10 مم CaCl2. تم الاحتفاظ بالغسيل الكلوي لكل عينة كمخزن مؤقت للتحكم. لتحديد الوزن الجزيئي، تم استشراب العينات التي تم تحليلها على عمود سيفاكريل S -1000 (300 × 10 مم) مزال مع المخزن المؤقت الخاص بها (المخازن المؤقتة A - C) بمعدل تدفق 12 مل/ساعة. تم تحديد متوسط الكتلة الجزيئية باستخدام مقياس ضوئي لتشتت الضوء بالليزر متعدد الزوايا ومقياس انكسار تفاضلي (Dawn DSP، Wyatt Technology، Santa Barbara، CA). بالنسبة لكل عينة، تم إجراء تحليل لمتوسط الوزن الجزيئي من خلال دمج ذروة الميوسين ذات الوزن الجزيئي المرتفع الرئيسي بين 6 و 15 مل من حجم الشطف مع زيادة انكسارية (dn/dc) قدرها 0.160 مل/جم. تم إجراء تحديد اللزوجة في مقياس اللزوجة الشعري أوستوالد عند درجة حرارة ثابتة تبلغ 25 درجة مئوية. تم تخفيف العينات في مخازنها (أ- ج) لإعطاء تركيز يتراوح بين 29 و 204 ميكروغرام/مل. بالنسبة لكل عينة، تم قياس وقت التدفق في مقياس اللزوجة خمس مرات وتم حساب متوسطه. اللزوجة الداخلية [η]=limc→0ηspecc=limc→0t -t0t0c (المعادلة 1) حيث t و t 0 هما أوقات تدفق العينة والمخزن المؤقت، على التوالي، و c هو تركيز الميوسين MUC5B. تم قياس اللزوجة الجوهرية [η] عن طريق رسم اللزوجة المخفضة كدالة لتركيز الميوسين (مخطط هاجينز). من المعادلة 1، أعطى الخط المستقيم المركب بتركيز صفري اللزوجة الجوهرية. كانت ارتباطات الخط المستقيم أعلى من 0.98. تم تنقية مخاطين MUC5B من اللعاب، بالطرق المعمول بها (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002 ؛ 362: 289-296 Crossref PubMed Scopus (70) الباحث العلمي من Google). تمت موازنة اللعاب في البداية في 6 م GdmCl وتم تجزئته حسب كروماتوغرافيا استبعاد الحجم والطرد المركزي المتدرج الكثافة من خطوتين في 4 م GdmCl. تم تحويل هذا المستحضر إلى محاليل أيونية ذات صلة قبل القياسات. تحضير الميوسين من اللعاب في ظل ظروف غير مشبعة - تم تقليب اللعاب الطازج برفق طوال الليل عند 4 درجات مئوية بحجم مساوٍ لـ 0.2 م كلوريد الصوديوم. كان الرقم الهيدروجيني 6.2–7.0. بعد الطرد المركزي (4400 × جم، 30 دقيقة، 4 درجات مئوية)، تم تجزئة المادة الطافية عن طريق الطرد المركزي متدرج الكثافة المتوازن (كثافة البدء، 1.45 مجم/مل) في CsCl/0.1 م NaCl، الرقم الهيدروجيني 6.5، في دوار بيكمان Ti45 عند 40،000 دورة في الدقيقة لمدة 65 ساعة عند 15 درجة مئوية. تم تجميع الأجزاء عالية الكثافة التي تحتوي على ميوسين MUC5B، وتحليلها مقابل 0.1 م كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 6.5، وتخزينها عند 4 درجات مئوية بعد إضافة 0.05 ٪ (وزن/حجم) أزيد الصوديوم. تم رسم جزء 25 مل من هذا المستحضر كروماتوغرافيًا على عمود استبعاد الحجم (1000 × 52 مم، سيفاروز CL -2B) مزال في 0.1 م كلوريد الصوديوم، 10 مم EGTA، الرقم الهيدروجيني 8.0، بمعدل تدفق 24 مل/ساعة. تم تجميع كسور الميوسين MUC5B، في الحجم الفارغ للعمود، وتم تحليلها مقابل 0.1 متر من كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 6.5، وتم تركيز جزء منها ضد البولي إيثيلين جلايكول (5 ٪ وزن/حجم) واختبارها للتأثيرات المعتمدة على الكالسيوم على انتشار التتبع بواسطة كونفوكال فراب. التعرف على البروتين عن طريق قياس الطيف الكتلي - تم تقليل قسائم الجزء المحتوي على الميوسين MUC5B عالي الكثافة الذي تمت تنقيته بواسطة تدرج كثافة CsCl في ظل ظروف غير مشبعة (انظر أعلاه) (10 مم DTT لمدة ساعتين) وتم ألكلته (25 مم iodoacetamide لمدة 30 دقيقة في الظلام) ثم تم تحللها ضد الماء وتجفيفها بالتجميد. بالإضافة إلى ذلك، تم رسم قسمة 5 مل من الجزء المحتوي على الميوسين MUC5B عالي الكثافة المجمع كروماتوغرافيًا على عمود استبعاد الحجم (600 × 10 مم، سيفاروز CL -2B) تم شطفه في 0.1 م كلوريد الصوديوم، الرقم الهيدروجيني 6.5، يحتوي على 10 مم كلوريد الكالسيوم 2 بمعدل تدفق 60 مل/ساعة. تم تقليل جزء حجم الفراغ وألكلته كما هو موضح أعلاه. تم هضم كلا المستحضرين بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية مع 1 ميكروغرام من التربسين لكل 10 ميكروغرام من البروتين في درجة حموضة بيكربونات الأمونيوم 100 مم 8.0. تم فصل الببتيدات الثلاثية بواسطة كروماتوغرافيا الطور العكسي وتحليلها في خط مستقيم بواسطة الأيونات الموجبة ESI - MS - MS باستخدام مطياف الكتلة الدقيقة Q - ToF (Micromass، مانشستر، المملكة المتحدة). تم إدخال العينات عبر نظام كروماتوغرافيا سائل شعري مزود بوحدة تحديد مجرى (Micromass). تم فصل القوالب (10–50 ميكرولتر) من العينات على عمود Pepmap (0.075 × 150 مم) مع تدرج 5 ٪ أسيتونيتريل في 0.1 ٪ حمض الفورميك إلى 25 ٪ أسيتونيتريل في 0.1 ٪ حمض الفورميك أكثر من 30 دقيقة بمعدل تدفق 200 نانولتر/دقيقة. تم تكرار هذه العملية مرتين لكل عينة، وتم استبعاد الببتيدات التي تم تحديدها في الجولة الأولى من التحليل الثاني. تم تحليل البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام قواعد بيانات SwissProt و Trembl باستخدام برنامج خادم Proteinlynx العالمي 1.1 (Micromass). تم تعيين المعلمات على تحمل كتلة الببتيد 100 - mDa، وأكسدة الميثيونين وتعديل كربوكسي أميدوميثيل السيستين. تم فحص طيف MS - MS لكل ببتيد مطابق بشكل فردي مع معايير القبول المتمثلة في أن الكتل الأيونية الأصلية والشظية كانت ضمن حدود التسامح المعايرة وأن الطيف يحتوي على سلسلة من أربعة أيونات متتالية على الأقل. تحضير عينات لقياسات انتشار التتبع - لجميع قياسات انتشار التتبع، الكريات الدقيقة من البوليسترين الفلورسنت (متوسط القطر 499 نانومتر)، محضنة مسبقًا بألبومين مصل البقر (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002 ؛ 362: 289-296 Crossref PubMed Scopus (70) Google Scholar)، كانت مختلطة، 2 ٪ (وزن/حجم)، مع العينات، ومتوازنة بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية. تم إجراء جميع قياسات FRAP متحدة البؤرة على محاليل اللعاب و MUC5B في وجود 0.1 متر من كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 6.2–7.0 وعند 25 درجة مئوية، باستثناء التجارب على الاعتماد على درجة الحرارة التي تمت فيها موازنة العينات لمدة 30 دقيقة عند درجات حرارة تتراوح من 15-52.5 درجة مئوية. لتحديد الاعتماد على تركيز انتشار التتبع، تم تركيز اللعاب في البداية عن طريق غسيل الكلى ضد مبيدات الأحماض المائية. بالنسبة للقياسات في وجود أو عدم وجود 10 مم من CaCl2، كان تركيز MUC5B في اللعاب يصل إلى 0.1 مجم/مل. في وجود 10 ملم EGTA كان تركيز MUC5B يصل إلى 0.960 ملغ/مل. تم تخفيف عينات MUC5B التي تمت تنقيتها في ظل ظروف تغيير الطبيعة في 0.1 متر من كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 6.5، وتم إجراء قياسات على محاليل تصل إلى 1.29 مجم/مل. لتحديد تأثيرات الكاتيونات على انتشار التتبع، تمت إضافة أملاح الكاتيونات ثنائية التكافؤ (CaCl2 و MgCl2 و MnCl2 و ZnCl2) أو EGTA لإعطاء تركيزات نهائية تصل إلى 4 مم. لتقييم قابلية انعكاس التأثيرات، بعد إضافة CaCl2، تمت إضافة EGTA إلى تركيز مكافئ لـ CaCl2 وتم تكرار قياسات FRAP متحدة البؤرة. لتحديد تأثير المنظفات على انتشار التتبع، تمت إضافة تريتون X -100 بنسبة تصل إلى 2 ٪ (حجم/حجم) إلى محاليل اللعاب. قياسات الانتشار عن طريق استعادة التألق المتحد البؤر- FRAP - بعد إجراء تجارب التبييض الضوئي باستخدام مجهر ليزر متحد البؤر (MRC -1000، Bio - Rad، Hemel Hempstead، UK) باستخدام مجهر التألق الفوقي المستقيم (Optiphot 2، Nikon، Japan) (16Gribbon P. Hardingham TE Biophys. J. 1998; 75: 1032-1039 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (112) Google Scholar). بالنسبة لتجارب انتشار التتبع، تم إغلاق عينات 10 ميكرولتر تحتوي على 499 نانومتر من الكريات الدقيقة تحت أغلفة زجاجية على شريحة مجهرية مسطحة. تحدد تقنية FRAP متحدة البؤر معاملات الانتشار الانتقالي الجانبي، والتي تم حسابها من الاعتماد الزمني لمخططات اللحظة الثانية من التوزيع المتوسط شعاعيًا للفلوروفور المبيض (16Gribbon P. Hardingham TE Biophys. J. 1998 ؛ 75: 1032-1039 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (112) باحث جوجل، 17Gribbon P. Heng B.C. Hardingham T.E. Biophys. ي. 1999 ؛ 77: 2210-2216 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (100) الباحث العلمي من Google، 18Gribbon P. Heng B.C. Hardingham T.E. Biochem. J. 2000; 350: 329-335 Crossref PubMed Scopus (72) Google Scholar, 21Kubitscheck U. Wedekind P. Peters R. Biophys. J. 1994 ؛ 67: 948-956 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (71) الباحث العلمي من Google). تم إجراء خمس نسخ متماثلة لكل تجربة. في تجارب الاعتماد على درجة الحرارة، تم التحكم في درجة الحرارة باستخدام نظام التبريد والتدفئة (PE -60، Linkam Instruments، Tadworth، UK) المرفق بحامل الشريحة على المجهر متحد البؤر. تم حساب اعتماد تركيز معاملات الانتشار الانتقالي للمقتفي في اللعاب و MUC5B المنقى باستخدام معادلة القياس لانتشار المقتفي في شبكات البوليمر شبه المخففة (20Phillies GDJJ Phys. CHEM. 1989 ؛ 93: 5029-5039 Crossref Scopus (171) Google Scholar) في المعادلة 2، D= D0exp (- βcν)(المعادلة 2) حيث D هو معامل انتشار التتبع الانتقالي الجانبي الظاهر المقاس، D 0 هو معامل الانتشار الحر، و β و ν هي ثوابت تجريبية وترتبط بمتوسط حجم مسام الشبكة (19DeSmedt S.C. Lauwers A. Demeester J. Engelborghs Y. Demey G. Du M. الجزيئات الكبيرة. 1994 ؛ 27: 141-146 Crossref Scopus (74) Google Scholar) (المعادلة 3)، والتي تصف المسافة بين نقاط تشابك السلسلة (22De Gennes P.G. مفاهيم القياس في فيزياء البوليمر. مطبعة جامعة كورنيل، إيثاكا، NY1979 الباحث العلمي من Google) في المعادلة 3.- d/ln(D/D0)(المعادلة 3) في هذه المعادلة د هو قطر المتتبع. هذا يفترض أن البوليمر يشكل شبكة منتظمة من الجدائل المرتبطة. بالنسبة للبوليمرات، مثل محاليل الميوسين، التي تكون فيها الارتباطات بين السلاسل عابرة وتكون الشبكة المتكونة ديناميكية، فإن البعد المتوسط يمثل توزيع أحجام المسام الظاهرة. في المحاليل شبه المخففة للبوليمرات، يوفر هذا التحليل لانتشار التتبع، الذي يعطي حجمًا مساميًا ظاهريًا، مقياسًا مشتركًا لتشابك السلسلة، جنبًا إلى جنب مع أي تأثير إضافي لارتباط محدد بين السلاسل. تم تقييم ارتباط الكالسيوم - الكالسيوم المرتبط بجزء الميوسين MUC5B عالي الكثافة الذي تمت تنقيته في ظل ظروف خفيفة غير قابلة للتطهير من خلال كروماتوغرافيا استبعاد الحجم. تمت إضافة 45CaCl2 (3.256 Ci/mmol) إلى جزء الميوسين (500 ميكرولتر عند 50 ميكروغرام/مل في 0.1 متر من كلوريد الصوديوم، الرقم الهيدروجيني 6.5) إلى تركيز نهائي قدره 70 ميكرومتر وتم تحضينه طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. تم تصوير العينة كروماتوغرافيًا على عمود من السيفاروز CL -2B (6 × 100 مم) مزال في 0.1 م كلوريد الصوديوم، الرقم الهيدروجيني 6.5. تم جمع الكسور (250 ميكرولتر)، وتم قياس النشاط الإشعاعي عن طريق عد الوميض. كما تم تحديد ربط الكالسيوم (على النحو الوارد أعلاه) بعد معالجة جزء الميوسين عالي الكثافة بـ 6 م من GdmCl. تم تحليل عينة من الميوسين إلى 6 م GdmCl (الرقم الهيدروجيني 6.2) بين عشية وضحاها عند 4 درجات مئوية ثم عادت إلى 0.1 م NaCl، الرقم الهيدروجيني 6.5، قبل إضافة 45CaCl2 المشعة. كما تمت معالجة جزء الميوسين عالي الكثافة عن طريق إضافة 10 مم من مادة دي تي تي لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية قبل الحضانة باستخدام الكالسيوم المشع طوال الليل في درجة حرارة الغرفة والاستشراب (كما هو مذكور أعلاه). لتقدير تقارب تركيزات ربط الكالسيوم المختلفة من 45CaCl2 المشعة (0.63 إلى 15.8 ميكرومتر، 3.256 سي/مليمول) تمت إضافتها إلى 500 ميكرولتر من جزء الميوسين عالي الكثافة (تركيز MUC5B 15 ميكروغرام/مل في 0.1 م كلوريد الصوديوم، الرقم الهيدروجيني 6.5). تم تصوير العينات كروماتوغرافياً على أعمدة استبعاد حجم PD -10 (سيفادكس G -25) مصفوفة في 25 مم كلوريد الصوديوم، 20 مم تريس، الرقم الهيدروجيني 7.0، وتم قياس النشاط الإشعاعي في الكسور (500 ميكرولتر) عن طريق عد التلألؤ. أظهر العمل السابق الذي يقيس انتشار مادة التتبع في كرات البوليسترين الفلورية المجهرية بواسطة برنامج FRAP متحد البؤر أن MUC5B اللعابي النقي من GdmCl كان أكثر نفاذية لانتشار مادة التتبع من اللعاب بتركيزات مماثلة من MUC5B mucin (15Raynal B.D. Hardingham T.E. Thornton D.J. Sheehan J.K. Biochem. J. 2002 ؛ 362: 289-296 Crossref PubMed Scopus (70) الباحث العلمي من Google). لذلك قمنا بالتحقيق في خصائص اللعاب لاكتشاف أساس هذا الاختلاف في التنظيم الجزيئي. أظهر انتشار التتبع في اللعاب ومحلول MUC5B النقي من GdmCl انخفاضًا يعتمد على التركيز في انتشار الكريات الدقيقة (قطر 499 نانومتر) (الشكل 1 أ). اتبع هذا الشكل العام المتوقع لتشابك البوليمرات عالية الوزن الجزيئي (انظر المعادلة 2) (فيزياء 20Phillies G.D.J.J. الكيمياء. 1989 ؛ 93: 5029-5039 Crossref Scopus (171) الباحث العلمي من Google). من نتائج انتشار التتبع، تم حساب التغير في حجم المسام الظاهر مع التركيز (انظر "الإجراءات التجريبية"، المعادلة 3) (الشكل 1B). أظهر هذا أن الحجم المسامي الظاهر في محلول MUC5B النقي من GdmCl كان أكبر أربع مرات من اللعاب، عند استقراءه بتركيز MUC5B مماثل (100 ميكروغرام/مل) بالقرب من ذلك الموجود من الناحية الفسيولوجية. لم يكن الاختلاف بسبب تأثيرات القوة الأيونية، لأنه تم تحليل كلا المستحضرين في 0.1 متر من كلوريد الصوديوم. لفهم أساس الاختلاف في حجم المسام الظاهر، أجرينا المزيد من تجارب انتشار التتبع على اللعاب بتركيزات MUC5B في النطاق المتوسط لمنحنى الاعتماد على التركيز (45–55 ميكروغرام/مل، الشكل 1A). عند هذا التركيز، يعكس أي تغيير في انتشار التتبع التغيرات في تنظيم الجزيئات الكبيرة في اللعاب التي تحدد معدل الانتشار. تأثير الكالسيوم و EGTA على اللعاب - تسببت إضافة CaCl2، حتى 4 مم إلى اللعاب في 0.1 متر من كلوريد الصوديوم، في انخفاض كبير في انتشار الكريات الدقيقة، والتي انخفضت من 5.6 × 10–9 إلى 1.8 × 10–9 cm2.s-1 (الشكل 1C). من قياسات الانتشار هذه، انخفض حجم المسام الظاهر في اللعاب (المحسوب من المعادلة 3، انظر "الإجراءات التجريبية ") من 1200 إلى 300 نانومتر بعد إضافة 4 مم من CaCl2 (الشكل 1D). في تجربة مماثلة بنفس تركيز اللعاب، أدت إضافة EGTA إلى زيادة انتشار التتبع (الشكل 1C)، وعند أكثر من 3 مم EGTA أصبح الانتشار مساويًا للانتشار الحر. أشارت النتيجة إلى أن EGTA كانت تخلب الكالسيوم في اللعاب وتسبب زيادة في انتشار التتبع. زاد حجم المسام الظاهرية المحسوبة من 1200 إلى 7000 نانومتر في وجود EGTA 2.5 مم (الشكل 1D). وبالتالي زاد حجم المسام الظاهر للعاب من قياسات انتشار التتبع ست مرات بواسطة EGTA. تشير هذه التغييرات الرئيسية في انتشار المتتبع بتركيز ثابت من اللعاب إلى أن الكالسيوم له تأثير كبير على تنظيم الجزيئات الكبيرة في اللعاب. تم إظهار قابلية عكس هذا التأثير من خلال تحليل متحد البؤر لعينة عولجت بـ EGTA ثم تمت إعادة موازنتها بالكالسيوم وأعيد اختبارها. عاد انتشار التتبع الذي زاده EGTA إلى معدل منخفض في وجود الكالسيوم (النتائج غير معروضة). كان تأثير الكالسيوم مستقلاً عن الرقم الهيدروجيني في النطاق المحايد الرقم الهيدروجيني 6–8 (النتائج غير موضحة). اقترحت التجارب أن الكالسيوم كان من السهل ربطه وإزالته من مواقع التفاعل وأن التغيير في التنظيم الجزيئي الكبير في اللعاب كان قابلاً للعكس بحرية. تم الحصول على تقييم أكثر اكتمالاً لتأثيرات الكالسيوم على انتشار التتبع على النطاق الكامل لتركيز اللعاب (الشكل 1A). كان هناك انخفاض كبير في انتشار التتبع في جميع أنحاء نطاق التركيز مقارنة باللعاب غير المعالج، مع اكتشاف التأثير بتركيزات منخفضة جدًا من MUC5B (5.5 ميكروغرام/مل). على النقيض من ذلك، في وجود EGTA، كان اللعاب أكثر نفاذية لانتشار التتبع، ولم يتم الكشف عن التأثيرات على انتشار الكرات الدقيقة إلا أعلى من 240 ميكروغرام/مل (الشكل 1A). من هذه النتائج، أظهر حجم المسام الظاهر فرقًا يبلغ حوالي 20 ضعفًا بين اللعاب المعالج بـ EGTA - و CaCl2 (الجدول الأول) عند مقارنته بتركيز فسيولوجي. ومن المثير للاهتمام أن انتشار التتبع للكريات الدقيقة في محلول موسين MUC5B النقي من GdmCl أظهر اعتمادًا مماثلًا على التركيز كما هو الحال في اللعاب المعالج بـ EGTA (الشكل 1A).Table IAnalysis of tracer diffusionالتركيز الحرجالانتشار الجانبي D0 × 10-9 الحجم المقدر () عند 100 ميكروغرام/مل من MUC5Bμg/mlcm2 s -1nmSaliva36.910.9620Saliva plus 10 mm CaCl25.58.6130Saliva plus 10 mm EGTA24012.92600GdmCl MUC5B32412.92710GdmCl MUC5B plus 10 mm CaCl232013.22740 تم فحص هذه الملاحظات الأولية لتأثيرات الكالسيوم على انتشار التتبع بشكل أكبر من خلال قياس خاصيتين مستقلتين أخريين. كانت لزوجة اللعاب مماثلة لتلك التي حددها الآخرون سابقًا في ظل ظروف أيونية مماثلة (23Nordbo H. Darwish S. Bhatnagar R.S.J DENT. Res. 1984; 92: 306-314 الباحث العلمي من Google، 24Veerman E.C.I. Valentijn - benz M. Nieuw Amerogen A.V. J. Biol. Buccale. 1989 ؛ 17: 297-306 PubMed Google Scholar). ومع ذلك، مع إضافة 10 مم CaCl2، كانت هناك زيادة كبيرة في اللزوجة الجوهرية (1033 إلى 1233 مل/جم)، ومع 10 مم EGTA كان هناك انخفاض كبير في اللزوجة الجوهرية (1033 إلى 733 مل/جم) (الشكل 2 أ والجدول الثاني). وبالتالي فإن وجود الكالسيوم جعل اللعاب أكثر لزوجة. أظهر تحليل اللعاب الأصلي عن طريق ترشيح الهلام على S -1000 جنبًا إلى جنب مع تحليل مراكز التسوق أنه يحتوي على نسبة عالية من الوزن الجزيئي بمتوسط وزن جزيئي تقريبي 28 × 106. في وجود CaCl2 (10 مم)، أظهر توزيع الوزن الجزيئي لنفس جزء الوزن الجزيئي المرتفع زيادة كبيرة إلى 62 × 106، وانخفض هذا بشكل كبير إلى 10 × 106 في وجود EGTA (10 مم) (الشكل 2 ب والجدول الثاني). وبالتالي تسبب الكالسيوم في زيادة كبيرة في (أ) لزوجة اللعاب و (ب) متوسط الوزن الجزيئي لمكونات الوزن الجزيئي المرتفع في اللعاب. الجدول الثاني اللزوجة وتوزيع الوزن الجزيئي [η] متوسط الوزن الجزيئيml ·g -1× 106Saliva103327.6Saliva plus 10 mm CaCl2120361.8Saliva plus 10 mm EGTA73310.1 طاولة مفتوحة في علامة تبويب جديدة تأثير القوة الأيونية المذيبة والكاتيونات ثنائية التكافؤ (Mg2 + و Mn2 + و Zn2 +) على انتشار التتبع في اللعاب - لم يتأثر تأثير الكالسيوم على انتشار التتبع في اللعاب بتركيز كلوريد الصوديوم 0.1 إلى 2 متر (الشكل 3 أ). وبالتالي، كان من غير المرجح أن يكون تأثير الكالسيوم بسبب التفاعل الكهروستاتيكي البسيط بين الجزيئات الكبيرة داخل اللعاب. تم التحقيق في آثار الأيونات ثنائية التكافؤ الأخرى. مع إضافة MgCl2 و MnCl2 و ZnCl2 حتى 4 مم، لم يكن هناك تغيير في انتشار التتبع (الشكل 3B). أظهرت النتائج أن أيونات المعادن ثنائية التكافؤ الشائعة الأخرى لا يمكن أن تحل محل أيونات الكالسيوم، وبالتالي فإن الكالسيوم له تأثير محدد على التنظيم الجزيئي الكبير في اللعاب. تم تحديد تأثير درجة الحرارة على انتشار التتبع في انتشار اللعاب على اللعاب المتوازن عند درجة حرارة مختلفة (15–52.5 درجة مئوية) (الشكل 3C). مع زيادة درجة الحرارة، زاد انتشار التتبع للكريات الدقيقة بنسبة 20 ٪ على النطاق الكامل لدرجة الحرارة، عند تصحيحه لتأثير تغيرات لزوجة المذيب على انتشار التتبع. كان التأثير قابلاً للعكس، لأنه عند التبريد، انخفض انتشار الكريات الدقيقة وعاد إلى القيمة الأولية. من