La mousse Physcomitrella patens contient des niveaux élevés d'acide arachidonique et des quantités moindres d'acide eicosapentaénoïque. Nous rapportons ici l'identification et la caractérisation d'une Δ5-désaturase de P. patens associée à la synthèse de ces acides gras. Un ADNc complet pour cette désaturase a été identifié par des recherches dans des bases de données basées sur l'homologie avec des séquences d'ADNc connus de Δ5-désaturase provenant d'espèces fongiques et d'algues. L'ADNc de P. patens résultant code pour un polypeptide de 480 acides aminés qui contient un domaine de type cytochrome b5 N-terminal prédit ainsi que trois domaines riches en histidine. L'expression de l'enzyme dans Saccharomyces cerevisiae a entraîné la production de l'acide arachidonique contenant de l'acide gras Δ5 dans les cellules qui ont reçu de l'acide di-homo-γ-linolénique. De plus, l'enzyme exprimée a généré des produits de Δ5-désaturation avec les substrats C20 acides ω-6 eicosadiénoïque et ω-3 eicosatriénoïque, mais aucun produit n'a été détecté avec les acides gras linoléique et α-linolénique en C18 ou avec les acides gras adrénique et docosapentaénoïque en C22. Lorsque la séquence génomique correspondante de P. patens a été perturbée par un remplacement par recombinaison homologue, une altération spectaculaire de la composition en acides gras a été observée, c'est-à-dire une augmentation des acides di-homo-γ-linolénique et eicosatétraénoïque accompagnée d'une disparition concomitante des acides Δ5-acide gras arachidonique et eicosapentaénoïque. De plus, la surexpression de l'ADNc de P. patens dans des protoplastes isolés d'une lignée perturbée a entraîné la restauration de la synthèse de l'acide arachidonique. La mousse Physcomitrella patens contient des niveaux élevés d'acide arachidonique et des quantités moindres d'acide eicosapentaénoïque. Nous rapportons ici l'identification et la caractérisation d'une Δ5-désaturase de P. patens associée à la synthèse de ces acides gras. Un ADNc complet pour cette désaturase a été identifié par des recherches dans des bases de données basées sur l'homologie avec des séquences d'ADNc connus de Δ5-désaturase provenant d'espèces fongiques et d'algues. L'ADNc de P. patens résultant code pour un polypeptide de 480 acides aminés qui contient un domaine de type cytochrome b5 N-terminal prédit ainsi que trois domaines riches en histidine. L'expression de l'enzyme dans Saccharomyces cerevisiae a entraîné la production de l'acide arachidonique contenant de l'acide gras Δ5 dans les cellules qui ont reçu de l'acide di-homo-γ-linolénique. De plus, l'enzyme exprimée a généré des produits de Δ5-désaturation avec les substrats C20 acides ω-6 eicosadiénoïque et ω-3 eicosatriénoïque, mais aucun produit n'a été détecté avec les acides gras linoléique et α-linolénique en C18 ou avec les acides gras adrénique et docosapentaénoïque en C22. Lorsque la séquence génomique correspondante de P. patens a été perturbée par un remplacement par recombinaison homologue, une altération spectaculaire de la composition en acides gras a été observée, c'est-à-dire une augmentation des acides di-homo-γ-linolénique et eicosatétraénoïque accompagnée d'une disparition concomitante des acides Δ5-acide gras arachidonique et eicosapentaénoïque. De plus, la surexpression de l'ADNc de P. patens dans des protoplastes isolés d'une lignée perturbée a entraîné la restauration de la synthèse de l'acide arachidonique. Acides gras polyinsaturés (AGPI), 4Les abréviations utilisées sont : AGPI, acide gras polyinsaturé ; ARA, acide arachidonique ; EPA, acide eicosapentaénoïque ; GC, chromatographie en phase gazeuse ; FAME, ester méthylique d'acide gras ; DHGLA, acide di-homo-γ-linolénique ; ETA, acide eicosatétraénoïque ou acide eicosatriénoïque.4Les abréviations utilisées sont : AGPI, acide gras polyinsaturé ; ARA, acide arachidonique ; EPA, acide eicosapentaénoïque ; GC, chromatographie en phase gazeuse ; FAME, ester méthylique d'acide gras ; DHGLA, acide di-homo-γ-linolénique ; ETA, acide eicosatétraénoïque ou acide eicosatriénoïque. les acides gras contenant 18 atomes de carbone ou plus avec deux doubles liaisons interrompues par du méthylène ou plus en position cis, ont fait l'objet d'une attention croissante ces dernières années parce qu'ils sont considérés comme ayant des effets bénéfiques sur la santé humaine et le développement lorsqu'ils sont inclus dans le régime alimentaire (1Horrocks L.A. Yeo Y.K. Pharmacol. Res. 1999 ; 40: 211-225Crossref PubMed Scopus (749) Google Scholar, 2Uauy R. Mena P. Wegher B. Nieto S. Salem Jr., N. Pediatr. Res. 2000 ; 47: 127-135Crossref PubMed Scopus (194) Google Scholar). Les AGPI à longue chaîne (≥C20) ne sont pas couramment présents dans les angiospermes ; cependant, ils sont présents dans certains gymnospermes (3WOLFF R.L. Pedrono F. Pasquier E. Marpeau A.M. Lipids. 2000 ; 35: 1-22Crossref PubMed Scopus (80) Google Scholar). Des proportions élevées d'accumulation d'AGPI se trouvent dans de nombreuses algues, mousses et fougères (4Ackman R.G. Tocher C.S. McLachlan J.J. Fish Res. Bd. Can. 1968 ; 25: 1603-1620Crossref Google Scholar, 5Dembitsky V.M. Prog. Lipid. Res. 1993 ; 32: 281-356Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar, 6Jamieson G.R. Reid E.H. Phytochemistry. 1975 ; 14: 2229-2232Crossref Scopus (26) Google Scholar). La fonction de ces AGPI à longue chaîne dans les membranes des plantes inférieures n'est toujours pas claire, alors que chez l'homme, ils jouent un rôle dans le métabolisme des eicosanoïdes (7Samuelsson B. Science. 1983 ; 220: 568-575Crossref PubMed Scopus (2307) Google Scholar). La mousse Physcomitrella patens (Hedw.) B. S. G. (Funariales, Bryophyta) contient des proportions élevées d'acide arachidonique (ARA) (20:4 Δ5,8,11,14) et de l'acide eicosapentaénoïque (EPA) (20:5 Δ5,8,11,14,17) (8Grimsley N.H. Grimsley J.M. Hartmann E. Phytochemistry. 1981 ; 20: 1519-1524Crossref Scopus (24) Google Scholar). Chez les mammifères, l'ARA (20:4 Δ5,8,11,14) et l'EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17) sont des précurseurs des molécules régulatrices à courte durée de vie, les eicosanoïdes, qui comprennent les prostaglandines, les leucotriènes et les thromboxanes (9Horrobin D.F. Prog. Lipid. Res. 1992 ; 31: 163-194Crossref PubMed Scopus (414) Google Scholar, 10Sayanova O.V. Napier J.A. Phytochemistry. 2004 ; 65: 147-158Crossref PubMed Scopus (136) Google Scholar, 11Roynette C.E. Calder p.c. Dupertuis Y.M. Pichard C. Clin. Nutr. 2004 ; 23: 139-151Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (219) Google Scholar). Ces composés agissent localement par le biais d'un processus autocrine ou paracrine sur les récepteurs de surface cellulaire liés aux protéines G. Cela conduit à l'activation de divers mécanismes de signalisation qui ont des effets sur de nombreuses fonctions cellulaires, notamment la chimiotaxie, la perméabilité vasculaire, l'inflammation, la vasoconstriction, la régulation du système immunitaire, la coagulation sanguine, la neurotransmission et le métabolisme du cholestérol (12Jump D.B. J. Biol. Chem. 2002 ; 277: 8755-8758Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (497) Google Scholar, 13Funk C.D. Science. 2001 ; 294: 1871-1875Crossref PubMed Scopus (2966) Google Scholar, 14Horrobin D.F. Rev. Contemp. Pharmacother. 1990 ; 1: 1-45Google Scholar). L'ARA (20:4 Δ5,8,11,14) et l'EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17) sont convertis en acide linoléique (18:2 Δ9,12) et en acide α-linolénique (18:3 Δ9,12,15), respectivement, par les activités de Δ6-désaturase, Δ6-élongase et Δ5-désaturase. Cette série de réactions est désignée comme la voie ω-6 pour la synthèse de l'ARA (20:4 Δ5,8,11,14) et la voie ω-3 pour la synthèse de l'EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17) (voir Fig. 1). On pense que les désaturases fonctionnent comme d'autres désaturases microsomiques de plantes supérieures et de levures, catalysant des réactions aérobies nécessitant le cytochrome b5 comme cofacteur. Les électrons sont transférés de la cytochrome b5 réductase NADH-dépendante via la molécule de cytochrome b5 contenant de l'hème à la désaturase d'acide gras (15Dailey H.A. Strittmatter P.J. Biol. Chem. 1980 ; 255: 5184-5189Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 16Smith M.A. Cross A.R. Jones O.T.G. Griffiths W.T. Stymne S. Stobart A.K. Biochem. J. 1990 ; 272: 23-29Crossref PubMed Scopus (86) Google Scholar, 17Pereira S.L. Leonard A.E. Mukerji P. Prostaglandins Leukotrienes Essent. Fatty Acids. 2003 ; 68: 97-106Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (181) Google Scholar, 18Wallis J.G. Watt J.L. Browse J. Trends Biochem. Sci. 2002 ; 27: 467-473Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (264) Google Scholar). Cependant, la caractérisation biochimique des désaturases membranaires a été limitée car elles sont difficiles à purifier en raison de leur association membranaire. L'analyse des séquences protéiques prédites pour les désaturases végétales supérieures ainsi que celles des cyanobactéries, des levures et des mammifères a révélé la présence de huit résidus d'histidine hautement conservés (19Shanklin J. Whittle E. Fox D.C. Biochemistry. 1994 ; 33: 12787-12794Crossref PubMed Scopus (638) Google Scholar). Parce que la mousse P. patens peut produire des proportions élevées d'ARA (20:4 Δ5,8,11,14) et un peu d'EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17) (8Grimsley N.H. Grimsley J.M. Hartmann E. Phytochemistry. 1981 ; 20: 1519-1524Crossref Scopus (24) Google Scholar), il peut servir de modèle pour étudier le mécanisme sous-jacent à la biosynthèse des AGPI. Seuls les gènes codant pour la Δ6-désaturase et la Δ6-élongase ont jusqu'à présent été clonés à partir de cet organisme (20Girke T. Schmidt H. Zahringer U. Reski R. Heinz E. Plant J. 1998 ; 15: 39-48Crossref PubMed Scopus (169) Google Scholar, 21Zank T.K. Zahringer U. Beckmann C. Pohnert G. Boland W. Holtorf H. Reski R. Lerchl J. Heinz E. Plant J. 2002 ; 31: 255-268Crossref PubMed Scopus (90) Google Scholar). Cependant, les gènes de P. patens codant pour la Δ5-désaturase qui catalysent l'étape suivante de la biosynthèse des AGPI n'ont pas encore été identifiés fonctionnellement. Cette mousse peut se propager végétativement à l'état haploïde (22Ashton N.W. Cove D.J. Mol. Gen. Genet. 1977 ; 154: 87-95Crossref Scopus (329) Google Scholar, 23Cove D.J. Annu. Rev. Genet. 2005 ; 39: 339-358Crossref PubMed Scopus (164) Google Scholar), qui simplifie l'analyse phénotypique après mutation ou transformation (24Schaefer D. Zryd J.P. Knight C.D. Cove D.J. Mol. Gen. Genet. 1991 ; 226: 418-424Crossref PubMed Scopus (186) Google Scholar). Les gènes peuvent être spécifiquement inactivés par un remplacement ciblé des gènes, qui se produit à haute fréquence chez P. patens (23Cove D.J. Annu. Rev. Genet. 2005 ; 39: 339-358Crossref PubMed Scopus (164) Google Scholar, 25Kamisugi Y. Cuming A.C. Cove D.J. Nucleic Acids Res. 2005 ; 33 : e173Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar). Dans la présente étude, une Δ5-désaturase associée à la biosynthèse de l'ARA (20:4 Δ5,8,11,14) et de l'EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17) chez P. patens a été identifiée fonctionnellement par expression hétérologue chez Saccharomyces cerevisiae, par perturbation ciblée du gène correspondant et par expression transitoire dans la lignée perturbée du gène. Matériaux - Les enzymes de restriction, les polymérases et les enzymes modifiant l'ADN ont été obtenues de New England Biolabs, sauf indication contraire. Tous les autres produits chimiques utilisés étaient de qualité réactif de Sigma. Les acides gras ont été achetés auprès de Nu-Check-Prep (Elysian, MN). Matériel végétal et conditions de croissance - La souche Gransden de P. patens (22Ashton N.W. Cove D.J. Mol. Genet. 1977 ; 154: 87-95Crossref Scopus (329) Google Scholar) a été utilisé tout au long des études. Des protonemates âgés de 7 jours ont été cultivés sur un milieu BCD solide auquel du tartrate de di-ammonium a été ajouté à 5 mm et cultivés à 25 °C sous une lumière continue fournie par des tubes fluorescents (26Knight C.D. Cove D.J. Cuming A.C. Quatrano R.S. Gilmartin P.M. Bowter C. Molecular Plant Biology. 2. Oxford University Press, Oxford, New York2002: 285-301Google Scholar). Isolement et manipulation de l'ARN - L'ARN total a été isolé à partir de 50 mg de poids frais de tissu protonémique à l'aide du mini kit RNeasy Plant (Qiagen), et 5 μg ont été transcrits avec le système PCR de transcription inverse Thermo-Script™ (Invitrogen) conformément aux instructions du fabricant. L'ADNc a été utilisé comme matrice pour l'amplification PCR avec des amorces. Isolation de l'ADN génomique - Environ 1 g de poids frais de tissu protonémique a été broyé en une poudre fine sous azote liquide à l'aide d'un mortier et d'un pilon pré-refroidis. L'ADN génomique a été extrait du tissu broyé à l'aide du kit d'extraction d'ADN génomique Nucleon™ PhytoPure™ (Amersham Biosciences) selon les instructions du fabricant. L'ADN a été récupéré par précipitation d'éthanol et dissous dans du tampon TE (Tris-HCl 10 mm, pH 7,5, EDTA 1 mm). Les amorces de clonage basées sur la PCR ont été synthétisées sur la base des données de séquence NCBI (27Zank T. Bauer J. Cirpus P. Abbadi A. Heinz E. Qiu X. Vrinten P. Sperling P. Domergue F. Meyer A. Kirsch J. PCT. 2005Google Scholar). L'amorce directe était PPFOR1, 5′-ATGGCGCCCCACTCTG-3′, et l'amorce inverse était PPREV1, 5′-TCAGCCATCGAGCCGAAACT-3′. La PCR a été réalisée dans un volume total de 50 μl. 10 μm chacune des amorces ont été utilisées pour l'amplification par PCR de l'ADNc inversé transcrit à partir de l'ARN total. Après la dénaturation initiale à 94 °C pendant 4 min, l'amplification a été effectuée en 35 cycles de 1 min à 94 °C, 0,5 min à 54 °C et 2,5 min à 72 °C, suivis d'une extension finale à 72 °C pendant 10 min supplémentaires. Les produits d'amplification ont été fractionnés sur des gels d'agarose à 1,0 % et directement ligaturés en pCR®2.1-TOPO® (Invitrogen) et les plasmides utilisés ont été transformés en cellules d'Escherichia coli chimiquement compétentes One Shot® (Invitrogen). L'ADN plasmidique a été purifié et séquencé dans les deux sens avec un ABI BigDye V3.1 et un séquenceur automatisé, donnant le plasmide PPDES5. Analyse fonctionnelle : Transformation de la levure - Le cadre de lecture ouvert de l'ADNc PPDES5 a été cloné à côté du promoteur inductible par le galactose GAL1 du vecteur d'expression de la levure pYES2 (Invitrogen). À cette fin, la PCR avec les amorces PPFOR1 et PPREV1 qui ajoutent des sites de restriction HindIII et XhoI aux extrémités 5′ et 3′, respectivement, a été utilisée pour amplifier le plasmide PPDES5. Le produit PCR amplifié a été ligaturé dans pCR®2.1-TOPO® (Invitrogen) et les plasmides utilisés ont été transformés à nouveau en cellules d'E. coli chimiquement compétentes One Shot® (Invitrogen). La totalité du cadre de lecture ouvert de la désaturase a été digérée par HindIII/XhoI et ligaturée dans les sites HindIII/XhoI du vecteur pYES2 (Invitrogen) pour donner le plasmide pYES2-DES5. Sa séquence a été vérifiée par séquençage de l'ADN. Les plasmides pYES2-DES5 et pYES2 ont été transformés en S. cerevisiae YPH499 (ATCC, Manassas, VA) par le kit de transformation S.c. Easy-Comp™ (Invitrogen). Après la sélection de l'uracile sur des plaques de gélose moyennes minimales, les cellules contenant les plasmides de levure ont été cultivées dans un milieu d'uracile de perte de mélange de suppléments complets (CSM-URA) (Krackeler Scientific) contenant 1,0 % (p/v) de raffinose comme source exclusive de carbone et 0,4 % de Tergitol Nonidet P-40 (Sigma) pour la solubilisation des acides gras. Pour les expériences d'expression génique, les cultures ont été cultivées à une densité optique (600 nm) d'environ0,3 dans un milieu CSM-URA (Krackeler Scientific). L'expression de la région codante PPDES5 a été induite par l'ajout de galactose à 2,0% (p/v). Des acides gras ont été ajoutés à 0,7 mm et des cultures ont été cultivées pendant 24 h à 28 °C. Perturbation génique ciblée de PPDES5 chez P. patens - Pour la perturbation de PPDES5 par ciblage génique, la séquence codante d'un clone génomique de PPDES5 a été remplacée par une cassette de terminaison 35S-hph-nos, résistante à l'hygromycine (23Cove D.J. Annu. Rev. Genet. 2005 ; 39: 339-358Crossref PubMed Scopus (164) Google Scholar), de sorte que la cassette de sélection était flanquée de 1536 et 1234 paires de bases (pb) de locus génomique homologue aux bras 5′ et 3′ de PPDES5, respectivement (voir Fig. 2). Deux paires d'amorces spécifiques (l'amorce 1, 5′ -TAGGCCCCACCCTGTTGCTTCG-3 ′, et l'amorce 2, 5′ -ATGGCCCCCAGTTGCTTCGTCCCAG-3 ′ ; l'amorce 3, 5′ -ATGTCGACCAGGCAAGTAAATAAGTGA-3 ′, et l'amorce 4, 5′ -ATATGCATGAACGAAAGTAGTCCTGTC-3 ′) ont été synthétisées sur la base de la séquence de génome de P. patens correspondante de la base de données du Joint Genome Institute du département américain de l'énergie (voir Fig. 2). Après amplification par PCR avec ces amorces à partir d'une matrice d'ADN génomique de type sauvage, les fragments de PCR de la longueur attendue (1536 et 1234 pb) ont été clonés séparément dans le vecteur pGEM®-TEasy (Promega), libérés par digestion avec ApaI et SalI/NsiI, respectivement, puis ligaturés dans le vecteur rr1 contenant la cassette de résistance à l'hygromycine. Par la suite, la construction de disruption a été digérée avec XhoI/HindIII, résultant en un fragment linéaire avec la cassette en son centre flanquée de séquences génomiques de 1252 et 554 pb. Cet ADN linéaire a été précipité et utilisé pour la transformation sans séparation du vecteur. Le transfert direct d'ADN induit par le polyéthylène lycol dans les protoplastes a été effectué comme décrit par Schaefer et al. (24Schaefer D. Zryd J.P. Knight C.D. Cove D.J. Mol. Gen. Genet. 1991 ; 226: 418-424Crossref PubMed Scopus (186) Google Scholar) avec modifications. Les protonèmes ont été régénérés pendant 7 jours sur un milieu solide contenant de l'hygromycine (25 μg/ml), transférés dans un milieu sans antibiotique pendant 7 jours et retransférés dans un milieu sélectif pendant 7 jours supplémentaires. Les plantes à forte croissance qui ont survécu à ce régime de sélection ont été définies comme des transformants stables. Analyse moléculaire - Les événements de ciblage ont été analysés par PCR et Southern blot. A cet effet, l'ADN génomique des plantes sauvages et transgéniques a été extrait et l'événement d'intégration 5'a été confirmé par des expériences de PCR avec l'amorce A (5' -GACCTACCGAACTTTCGA-3 ') correspondant à la séquence génomique de P. patens mais 164 pb en amont de l'extrémité 5' du vecteur de remplacement et l'amorce B (5'-ACCATCTGTGGTTAGCGTCC-3') dérivée de la région promotrice 35S de la cassette de sélection. L'événement d'intégration 3′ a également été confirmé par PCR avec l'amorce C (5′ -ATGAAAAAGCCTGAACTACCG-3 ′) dérivée de l'extrémité 5′ de la région codante hph et l'amorce D (5′ -GAACACTCAACTGTAGTAGC-3 ′) correspondant à la séquence génomique de P. patens mais 99 pb en aval de l'extrémité 3′ de la cassette de sélection (voir Fig. 2 pour l'emplacement des amorces). Les PCR ont été réalisées dans un volume total de 50 μl. Chaque réaction contenait 0,2 μm chacune des amorces, 200 μm chacune des dNTP, du tampon PCR et 2 ml de mélange d'enzymes Elongase® (Invitrogen). Les conditions de thermocyclage étaient les suivantes : dénaturation initiale pendant 4 min à 94 °C, suivie de 35 cycles de 1 min à 94 °C, 0,5 min à 50 °C, 5 min à 72 °C et terminée par une extension finale de 10 min à 72 °C. Pour l'analyse par Southern blot, des aliquotes de 1 μg d'ADN génomique de plantes sauvages et transgéniques ont été digérées avec les enzymes de restriction appropriées et séparées par électrophorèse sur gel d'agarose à 0,6 %. Les étapes finales de lavage ont été effectuées dans 0,1× SSC avec 0,1% de SDS à 65 °C. La détection a été réalisée avec un substrat chimioluminescent (CSPD ; Roche Applied Science). Expression génique transitoire de PPDES5 - Les amorces avec PPFOR2, 5′-CACCATGGCGCCCCACTCTG-3 ′ et PPREV2, 5′-TCAAGACCAGCCGCTCGCATCTTTCCAAGAGCCATCGAGCCGAAACT-3′ ont été utilisées pour l'amplification PCR de pYES2-DES5 avec KlentaqLA. 5 Breveté par W. Barnes. Les PCR ont été réalisées dans un volume total de 50 μl. Chaque réaction contient 0,4 μm chacune d'amorces, 100 μm chacune de dNTP, du tampon PCR, 1,5 mm MgCl2 et 0,5 μl de KlentaqLA.5 Les conditions de thermocyclage étaient les suivantes : dénaturation initiale pendant 4 min à 94 °C suivie de 28 cycles de 1 min à 94 °C, 0,5 min à 54 °C, 2,5 min à 72 °C et terminée par une extension finale de 10 min à 72 °C. Les produits d'amplification ont été incorporés directement dans le vecteur pENTR™/D-TOPO® (Invitrogen). Le plasmide de recombinaison résultant a la séquence PPDES5 flanquée de séquences de recombinaison attL. Il a ensuite été recombiné avec des sites attR en utilisant le mélange d'enzymes Gateway® LR Clonase™ II (Invitrogen). Cette réaction a transféré la séquence PPDES5 dans un vecteur de destination souhaité (tk1). Le vecteur de destination contenant un gène, PPDES5, entraîné par le promoteur 35S, a été transformé en protoplastes de la souche ciblée (24Schaefer D. Zryd J.P. Knight C.D. Cove D.J. Mol. Gen. Genet. 1991 ; 226: 418-424Crossref PubMed Scopus (186) Google Scholar). Les protoplastes régénérés ont été cultivés en milieu BCD liquide additionné de 5 mm de tartrate de di-ammonium et 6% de mannitol pendant 2 jours avant l'analyse des acides gras. Analyse des acides gras - Les acides gras totaux extraits des cultures de levures et de mousses ont été analysés par chromatographie en phase gazeuse (CG) des esters méthyliques. Les lipides des tissus de levure et de mousse ont été transméthylés avec 1% de méthoxyde de sodium dans le méthanol et 2,5% d'acide sulfurique dans le méthanol, respectivement, à 85 °C pendant 30 min. Les esters méthyliques d'acides gras (FAME) ont ensuite été extraits dans l'heptane. L'analyse GC des FAME a été réalisée à l'aide d'un chromatographe en phase gazeuse de la série Agilent 6890N équipé d'une colonne capillaire HP-INNOWax de 0,25 mm × 30 m × 0,25 mm et d'un détecteur à ionisation de flamme. Les acides gras ont été identifiés par comparaison avec les temps de rétention des étalons. Les pourcentages relatifs des acides gras ont été estimés à partir des zones de pic. Les acides gras correspondants ont en outre été caractérisés sur un dérivé de diéthylamide par chromatographie en phase gazeuse-spectrométrie de masse en utilisant la série Agilent 6890N fonctionnant à une tension d'ionisation de 70 eV avec une plage de balayage de 50-500 Da. Clonage d'une désaturase liée à la membrane de P. patens - La mousse de P. patens a retenu l'attention en raison de sa capacité à produire plusieurs AGPI, notamment l'ARA (20:4 Δ5,8,11,14) et l'EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17) (8Grimsley N.H. Grimsley J.M. Hartmann E. Phytochemistry. 1981 ; 20: 1519-1524Crossref Scopus (24) Google Scholar). Nous nous sommes donc intéressés à l'information moléculaire sous-jacente à la biosynthèse de ces acides gras. Pour identifier un gène codant pour la désaturase impliquée dans l'étape finale de la biosynthèse de l'ARA (20:4 Δ5,8,11,14) et de l'EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17), des recherches dans la base de données NCBI chez P. patens ont été effectuées et la séquence identifiée en fonction de son identité limitée avec d'autres Δ5-désaturases a été utilisée (27Zank T. Bauer J. Cirpus P. Abbadi A. Heinz E. Qiu X. Vrinten P. Sperling P. Domergue F. Meyer A. Kirsch J. PCT. 2005Google Scholar). cDNA from reverse-transcribed mRNA from 7-day-year-old protonemal tissue of P. patens was amplified by PCR. Un produit d'amplification contenant la longueur attendue a été cloné et séquencé. Le cadre de lecture ouvert de l'ADNc PPDES5 est de 1443 pb d'un début ATG à un codon d'arrêt TGA et code pour 480 acides aminés avec une masse moléculaire de 54,3 kDa. Les recherches dans les banques de données et les alignements avec cette séquence ont indiqué une similitude avec les désaturases acyl-lipidiques du résidu 190-454, avec un domaine de type cytochrome b5 dans la terminaison N du résidu 36-107. La comparaison des séquences d'acides aminés à l'aide du programme ClustalW a révélé que le PPDES5 a la plus forte homologie avec la Δ5-désaturase de l'hépatique Marchantia polymorpha (66% d'identité) (28Kajikawa M. Yamato K.T. Kohzu Y. Nojiri M. Sakuradani E. Shimizu S. Sakai Y. Fukuzawa H. Ohyama K. Plant Mol. Biol. 2004 ; 54: 335-352Crossref PubMed Scopus (51) Google Scholar) et partage également 36% d'identité avec la Δ5-désaturase de Dictyostelium discoideum (29Saito T. Morio T. Ochiai H. Eur. J. Biochem. 2000 ; 267: 1813-1818Crossref PubMed Scopus (22) Google Scholar, 30Saito T. Ochiai H. Eur. J. Biochem. 1999 ; 265: 809-814Crossref PubMed Scopus (17) Google Scholar) et Mortierella alpina (31Michaelson L.V. Lazarus C.M. Griffiths G. Napier J.A. Stobart A.K. J. Biol. Chem. 1998 ; 273: 19055-19059Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (142) Google Scholar), nécessaire à la désaturation des AGPI. L'alignement avec ces séquences indique que l'homologie se produit principalement dans le domaine de type cytochrome b5 qui sert de donneur d'électrons (encadré avec des lignes brisées sur la Fig. 3) et dans les trois zones de motif riches en histidine conservées (encadré sur la Fig. 3). Le domaine lié au cytochrome b5 contenait les huit résidus invariants typiques de la superfamille des cytochromes b5 (marqués d'astérisques sur la figure 3) et la présence d'une région de liaison à l'hème caractérisée par le motif HPGG vers la terminaison N (32Ledererer F. Biochimie (Paris). 1994 ; 76: 674-692Crossref PubMed Scopus (88) Google Scholar). Un donneur d'électrons contenant de l'hème est nécessaire pour la désaturation des acides gras, et le cytochrome b5 remplit cette fonction pour la désaturase liée à la membrane (16Smith M.A. Cross A.R. Jones O.T.G. Griffiths W.T. Stymne S. Stobart A.K. Biochem. J. 1990 ; 272: 23-29Crossref PubMed Scopus (86) Google Scholar, 33Mitchell A.G. Martin C.E. J. Biol. Chem. 1995 ; 270: 29766-29772Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (130) Google Scholar, 34Smith M.A. Jonsson L. Stymne S. Stobart A.K. Biochem. J. 1992 ; 287: 141-144Crossref PubMed Scopus (64) Google Scholar). Par conséquent, la séquence entière peut être considérée comme codant pour une protéine de fusion constituée d'un cytochrome b5 N-terminal et d'une désaturase. Le motif de séquence QIEHH de la troisième boîte d'histidine commence par une glutamine au lieu d'une histidine (marquée d'un triangle sur la figure 3), qui est la caractéristique des désaturases frontales mais ne se trouve pas dans d'autres désaturases telles que les Δ12- et Δ15-désaturases (35Sayanova O. Beaudoin F. Libisch B. Castel A. Shewry P.R. Napier J.A. J. Exp. Bot. 2001 ; 52: 1581-1585Crossref PubMed Scopus (61) Google Scholar, 36Sayanova O. Beaudoin F. Libisch B. Shewry P.R. Napier J.A. Biochem. Soc. Trans. 2000 ; 28: 636-638Crossref PubMed Google Scholar, 37Sperling P. Heinz E. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2001 ; 103: 158-180Crossref Scopus (59) Google Scholar). L'analyse fonctionnelle de PPDES5 dans Yeast—Fig. 4 montre les résultats de l'analyse GC des esters méthyliques d'acides gras de souches de levure, transformés avec la construction d'expression PPDES5 comme décrit sous « Procédures expérimentales », auxquels des substrats d'acides gras avaient été fournis. Un pic supplémentaire est apparent dans la trace obtenue à partir de pYES2-DES5 induite cultivée en présence d'acide di-homo-γ-linolénique (DHGLA) (20:3 Δ8,11,14) par rapport à un témoin vectoriel vide. Le temps de rétention du pic additionnel est identique à celui de l'ester méthylique de l'ARA authentique (20:4 Δ5,8,11,14). Ce composé présentait également un ion moléculaire de 318 m/z (l'ion moléculaire attendu pour le méthyl ARA) ainsi qu'un motif de fragmentation identique à celui de l'ester méthylique authentique du ARA. L'identité de ce composé a ensuite été vérifiée en obtenant le dérivé de diéthylamide afin de produire un spectre de masse spécifique à la structure. Comme le montre la figure 5, le spectre de masse du composé dérivatisé contenait un ion moléculaire de 359 m/z et un profil de fragmentation compatible avec le dérivé de diéthylamide ARA. Les cellules de levure transformées avec le plasmide pYES2-DES5 avaient donc acquis une activité Δ5-désaturase spécifique fonctionnelle et étaient maintenant capables de synthétiser l'ARA (20:4 Δ5,8,11,14) à partir du substrat DHGLA (20:3 Δ8,11,14). La Δ5-désaturase spécifique dans la levure transformée semble être un catalyseur efficace, avec 14,7% du substrat converti en ARA dans les conditions des expériences. Analyse par spectrométrie de masse FIGURE 5GC du dérivé diéthylamide du nouveau pic identifié dans la levure portant pYES2-DES5 en présence de DHGLA (20:3 Δ8,11,14). Une comparaison est présentée des spectres de masse du nouveau pic (A) et d'une norme ARA (20:4 Δ5,8,11,14) authentique (B) .Voir la visionneuse de grandes figures d'imageTélécharger l'image haute résolution (PPT) Pour tester si la Δ5-désaturase de P. patens était capable de désaturer d'autres substrats, des cultures de levure exprimant PPDES5 ont été complétées avec plusieurs acides gras (Tableau 1). Nous n'avons pas pu détecter de nouveaux pics lorsque les acides gras C18 et C22 ont été administrés à la levure ; cependant, lorsque 20:2 Δ11,14 et 20:3 Δ11,14,17 ont été fournis comme substrats, nous avons détecté de nouveaux pics avec des spectres de masse cohérents avec ceux du méthyle 20:3 Δ5,11,14 (13,5 %) et 20:4 Δ5,11,14,17 (14,5 %), respectivement (données non présentées). Par conséquent, la Δ5-désaturase de P. patens semble être spécifique des acides gras en C20. De plus, nous avons pu exclure l'activité de la Δ8-désaturase parce que nous n'avons pas pu détecter de substrats 20:3 Δ8,11,14 ou 20:4 Δ8,11,14,17 à partir de substrats 20:2 Δ11,14 et 20:3 Δ11,14,17, respectivement. 1Spécificité de substrat d'acide gras de P. patens Δ5-désaturase (PPDES5) Les cellules de levure transformées avec pYES2-DES5 ont été complétées avec différents acides gras. Les FAME des lipides totaux dans des conditions d'induction ont été analysés par CPG, en utilisant la détection par ionisation de flamme. La conversion a été calculée comme (produit × 100)/(substrat + produit) en utilisant les valeurs correspondant aux zones de crête des signaux correspondants. Substrats d'acides grasPourcentage de substrat converti18:2 (Δ9,12), acide ω-6 linoléique0,0 ± 0,018: 3 (Δ9,12,15), acide ω-3 α-linoléique0,0 ± 0,020: 2 (Δ11,14), acide ω-6 eicosadiénoïque13,5 ± 0,320: 3 (Δ8,11,14), ω-6 DHGLA14,7 ± 0,520:3 (Δ11,14,17), ω-3 ETA14,5 ± 0,322: 4 (Δ7,10,13,16), acide ω-6 adrénique0,0 ± 0,022:5 (Δ7,10,13,16,19), acide ω-3 docosapentaénoïque0,0 ± 0,0 Tableau ouvert dans un nouvel onglet Profil des acides gras dans P. patens Type sauvage - Des acides gras ω-6 et ω-3 ont été détectés dans des tissus de type sauvage, y compris des acides gras C16-20 saturés, mono- et polyinsaturés (Fig. 6). Le principal acide gras détecté était l'ARA (20:4 Δ5,8,11,14), qui est le produit de désaturation Δ5 de DHGLA (20:3 Δ8,11,14) dans la voie ω-6 (voir Fig. 1). Cependant, à partir de nos expériences, nous avons pu détecter très peu d'acide ω-3 eicosatétraénoïque (ETA) (20:4 Δ8,11,14,17) malgré la présence de son produit de désaturation Δ5, l'EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17). Remplacement de gène ciblé - Pour une preuve alternative de la fonction de PPDES5, nous avons analysé les acides gras totaux de type sauvage et les trois lignées transgéniques stables (K1-3) ayant la séquence codante PPDES5 remplacée par une cassette de sélection (Fig. 6). Contrairement au type sauvage, les lignées transgéniques sont dépourvues des acides gras insaturés ARA (20:4 Δ5,8,11,14) et EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17), produits de l'étape de désaturation Δ5, et d'une nette augmentation du taux de son substrat DHGLA (20:3 Δ8,11,14) et ETA (20:4 Δ8,11,14,17), respectivement. Analyse moléculaire des lignées transgéniques - L'intégration spécifique de l'ADN transformé dans le gène PPDES5 a été analysée par PCR en utilisant l'ADN génomique des trois lignées transgéniques (K1-3) et du type sauvage. Les emplacements des différentes amorces sont présentés dans la Fig. 2. L'extrémité 5′ de l'amorce A et l'extrémité 3′ de l'amorce D lient 164 pb en amont et 99 pb en aval des séquences génomiques 5′ et 3′flanquant la cassette de sélection, excluant ainsi les signaux PCR résultant de la contamination par l'ADN utilisé pour la transformation. PCR avec paire d'amorces A/B amplifiée a fr

El musgo Physcomitrella patens contiene altos niveles de ácido araquidónico y menores cantidades de ácido eicosapentaenoico. Aquí informamos la identificación y caracterización de una Δ5-desaturasa de P. patens que está asociada con la síntesis de estos ácidos grasos. Se identificó un ADNc de longitud completa para esta desaturasa mediante búsquedas en la base de datos basadas en la homología con secuencias de ADNc de Δ5-desaturasa conocidos de especies fúngicas y de algas. El ADNc de P. patens resultante codifica un polipéptido de 480 aminoácidos que contiene un dominio tipo citocromo b5 N-terminal predicho, así como tres dominios ricos en histidina. La expresión de la enzima en Saccharomyces cerevisiae dio como resultado la producción del ácido graso araquidónico que contiene Δ5 en células a las que se proporcionó ácido di-homo-γ-linolénico. Además, la enzima expresada generó productos de Δ5-desaturación con los sustratos C20 ácidos ω-6 eicosadienoico y ω-3 eicosatrienoico, pero no se detectaron productos con los ácidos grasos C18 linoleico y α-linolénico o con los ácidos grasos C22 adrenal y docosapentaenoico. Cuando la secuencia genómica correspondiente de P. patens se interrumpió por reemplazo a través de recombinación homóloga, se observó una alteración dramática en la composición de ácidos grasos, es decir, un aumento en los ácidos di-homo-γ-linolénico y eicosatetraenoico acompañado de una desaparición concomitante de los ácidos Δ5-ácidos grasos araquidónicos y eicosapentaenoicos. Además, la sobreexpresión del ADNc de P. patens en protoplastos aislados de una línea alterada dio como resultado la restauración de la síntesis de ácido araquidónico. El musgo Physcomitrella patens contiene altos niveles de ácido araquidónico y menores cantidades de ácido eicosapentaenoico. Aquí informamos la identificación y caracterización de una Δ5-desaturasa de P. patens que está asociada con la síntesis de estos ácidos grasos. Se identificó un ADNc de longitud completa para esta desaturasa mediante búsquedas en la base de datos basadas en la homología con secuencias de ADNc de Δ5-desaturasa conocidos de especies fúngicas y de algas. El ADNc de P. patens resultante codifica un polipéptido de 480 aminoácidos que contiene un dominio tipo citocromo b5 N-terminal predicho, así como tres dominios ricos en histidina. La expresión de la enzima en Saccharomyces cerevisiae dio como resultado la producción del ácido graso araquidónico que contiene Δ5 en células a las que se proporcionó ácido di-homo-γ-linolénico. Además, la enzima expresada generó productos de Δ5-desaturación con los sustratos C20 ácidos ω-6 eicosadienoico y ω-3 eicosatrienoico, pero no se detectaron productos con los ácidos grasos C18 linoleico y α-linolénico o con los ácidos grasos C22 adrenal y docosapentaenoico. Cuando la secuencia genómica correspondiente de P. patens se interrumpió por reemplazo a través de recombinación homóloga, se observó una alteración dramática en la composición de ácidos grasos, es decir, un aumento en los ácidos di-homo-γ-linolénico y eicosatetraenoico acompañado de una desaparición concomitante de los ácidos Δ5-ácidos grasos araquidónicos y eicosapentaenoicos. Además, la sobreexpresión del ADNc de P. patens en protoplastos aislados de una línea alterada dio como resultado la restauración de la síntesis de ácido araquidónico. Ácidos grasos poliinsaturados (PUFA), 4Las abreviaturas utilizadas son: PUFA, ácido graso poliinsaturado; ARA, ácido araquidónico; EPA, ácido eicosapentaenoico; GC, cromatografía de gases; FAME, éster metílico de ácido graso; DHGLA, ácido di-homo-γ-linolénico; ETA, ácido eicosatetraenoico o ácido eicosatrienoico.4Las abreviaturas utilizadas son: PUFA, ácido graso poliinsaturado; ARA, ácido araquidónico; EPA, ácido eicosapentaenoico; GC, cromatografía de gases; FAME, éster metílico de ácido graso; DHGLA, ácido di-homo-γ-linolénico; ETA, ácido eicosatetraenoico o ácido eicosatrienoico. Los ácidos grasos que contienen 18 o más átomos de carbono con dos o más dobles enlaces interrumpidos por metileno en la posición cis, han recibido una atención creciente en los últimos años porque se considera que tienen efectos beneficiosos sobre la salud humana y el desarrollo cuando se incluyen en la dieta (1Horrocks L.A. Yeo Y.K. Pharmacol. Res. 1999; 40: 211-225Crossref PubMed Scopus (749) Google Scholar, 2Uauy R. Mena P. Wegher B. Nieto S. Salem Jr., N. Pediatr. Res. 2000; 47: 127-135 Crossref PubMed Scopus (194) Google Scholar). Los PUFA de cadena larga (≥C20) no se encuentran comúnmente en las angiospermas; sin embargo, están presentes en algunas gimnospermas (3WOLFF R.L. Pedrono F. Pasquier E. Marpeau A.M. Lipids. 2000; 35: 1-22 Crossref PubMed Scopus (80) Google Scholar). Se encuentran altas proporciones de acumulación de PUFA en muchas algas, musgos y helechos (4Ackman R.G. Tocher C.S. McLachlan J.J. Fish Res. Bd. Can. 1968; 25: 1603-1620Crossref Google Scholar, 5Dembitsky V.M. Prog. Lipid. Res. 1993; 32: 281-356Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar, 6Jamieson G.R. Reid E.H. Phytochemistry. 1975; 14: 2229-2232 Crossref Scopus (26) Google Scholar). La función de estos PUFA de cadena larga en las membranas de las plantas inferiores aún no está clara, mientras que en los humanos desempeñan un papel en el metabolismo de los eicosanoides (7Samuelsson B. Science. 1983; 220: 568-575 Crossref PubMed Scopus (2307) Google Scholar). El musgo Physcomitrella patens (Hedw.) B. S. G. (Funariales, Bryophyta) contiene altas proporciones de ácido araquidónico (ARA) (20:4 Δ5,8,11,14) y algo de ácido eicosapentaenoico (EPA) (20:5 Δ5,8,11,14,17) (8Grimsley N.H. Grimsley J.M. Hartmann E. Phytochemistry. 1981; 20: 1519-1524 Crossref Scopus (24) Google Scholar). En mamíferos, ARA (20:4 Δ5,8,11,14) y EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17) son precursores de las moléculas reguladoras de vida corta, los eicosanoides, que comprenden las prostaglandinas, los leucotrienos y los tromboxanos (9Horrobin D.F. Prog. Lipid. Res. 1992; 31: 163-194Crossref PubMed Scopus (414) Google Scholar, 10Sayanova O.V. Napier J.A. Phytochemistry. 2004; 65: 147-158 Crossref PubMed Scopus (136) Google Scholar, 11 Roynette C.E. Calder P.C. Dupertuis Y.M. Pichard C. Clin. Nutr. 2004; 23: 139-151Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (219) Google Scholar). Estos compuestos actúan localmente a través de procesos autocrinos o paracrinos en los receptores de la superficie celular unidos a la proteína G. Esto conduce a la activación de varios mecanismos de señalización que tienen efectos sobre numerosas funciones celulares, incluida la quimiotaxis, la permeabilidad vascular, la inflamación, la vasoconstricción, la regulación del sistema inmunitario, la coagulación de la sangre, la neurotransmisión y el metabolismo del colesterol (12Jump D.B. J. Biol. Chem. 2002; 277: 8755-8758Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (497) Google Scholar, 13Funk C.D. Science. 2001; 294: 1871-1875 Crossref PubMed Scopus (2966) Google Scholar, 14Horrobin D.F. Rev. Contemp. Pharmacother. 1990; 1: 1-45Google Scholar). ARA (20:4 Δ5,8,11,14) y EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17) se convierten a partir de ácido linoleico (18:2 Δ9,12) y ácido α-linolénico (18:3 Δ9,12,15), respectivamente, por las actividades de Δ6-desaturasa, Δ6-elongasa y Δ5-desaturasa. Esta serie de reacciones se designa como la vía ω-6 para la síntesis de ARA (20:4 Δ5,8,11,14) y la vía ω-3 para la síntesis de EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17) (ver Fig. 1). Se cree que las desaturasas funcionan como otras desaturasas microsomales de plantas superiores y levaduras, catalizando reacciones aeróbicas que requieren el citocromo b5 como cofactor. Los electrones se transfieren de la citocromo b5 reductasa dependiente de NADH a través de la molécula de citocromo b5 que contiene hemo a la ácido graso desaturasa (15Dailey H.A. Strittmatter P. J. Biol. Chem. 1980; 255: 5184-5189Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 16Smith M.A. Cross A.R. Jones O.T.G. Griffiths W.T. Stymne S. Stobart A.K. Biochem. J. 1990; 272: 23-29Crossref PubMed Scopus (86) Google Scholar, 17Pereira S.L. Leonard A.E. Mukerji P. Prostaglandins Leukotrienes Essent. Fatty Acids. 2003; 68: 97-106Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (181) Google Scholar, 18Wallis J.G. Watt J.L. Browse J. Trends Biochem. Sci. 2002; 27: 467-473Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (264) Google Scholar). Sin embargo, la caracterización bioquímica de las desaturasas unidas a la membrana ha sido limitada porque son difíciles de purificar debido a su asociación a la membrana. El análisis de las secuencias de proteínas predichas para las desaturasas de plantas superiores junto con las de cianobacterias, levaduras y mamíferos reveló la presencia de ocho residuos de histidina altamente conservados (19Shanklin J. Whittle E. Fox D.C. Biochemistry. 1994; 33: 12787-12794 Crossref PubMed Scopus (638) Google Scholar). Debido a que el musgo P. patens puede producir altas proporciones de ARA (20:4 Δ5,8,11,14) y algo de EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17) (8Grimsley N.H. Grimsley J.M. Hartmann E. Phytochemistry. 1981; 20: 1519-1524 Crossref Scopus (24) Google Scholar), puede servir como modelo para estudiar el mecanismo subyacente a la biosíntesis de los AGPI. Solo los genes que codifican la Δ6-desaturasa y la Δ6-elongasa se han clonado hasta ahora a partir de este organismo (20Girke T. Schmidt H. Zahringer U. Reski R. Heinz E. Plant J. 1998; 15: 39-48Crossref PubMed Scopus (169) Google Scholar, 21Zank T.K. Zahringer U. Beckmann C. Pohnert G. Boland W. Holtorf H. Reski R. Lerchl J. Heinz E. Plant J. 2002; 31: 255-268Crossref PubMed Scopus (90) Google Scholar). Sin embargo, los genes de P. patens que codifican la Δ5-desaturasa que catalizan el siguiente paso en la biosíntesis de PUFA aún no se han identificado funcionalmente. Este musgo se puede propagar vegetativamente en estado haploide (22Ashton N.W. Cove D.J. Mol. Gen. Genet. 1977; 154: 87-95Crossref Scopus (329) Google Scholar, 23Cove D.J. Annu. Rev. Genet. 2005; 39: 339-358Crossref PubMed Scopus (164) Google Scholar), que simplifica el análisis fenotípico después de la mutación o transformación (24Schaefer D. Zryd J.P. Knight C.D. Cove D.J. Mol. Gen. Genet. 1991; 226: 418-424Crossref PubMed Scopus (186) Google Scholar). Los genes pueden inactivarse específicamente mediante el reemplazo génico dirigido, que ocurre con alta frecuencia en P. patens (23Cove D.J. Annu. Rev. Genet. 2005; 39: 339-358Crossref PubMed Scopus (164) Google Scholar, 25Kamisugi Y. Cuming A.C. Cove D.J. Nucleic Acids Res. 2005; 33: e173Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar). En el presente estudio, una Δ5-desaturasa asociada con la biosíntesis de ARA (20:4 Δ5,8,11,14) y EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17) en P. patens se identificó funcionalmente mediante la expresión heteróloga en Saccharomyces cerevisiae, mediante la alteración dirigida del gen correspondiente y mediante la expresión transitoria en la línea alterada del gen. Las enzimas de restricción de materiales, polimerasas y enzimas modificadoras de ADN se obtuvieron de New England Biolabs a menos que se indique lo contrario. Todos los demás productos químicos utilizados eran de grado reactivo de Sigma. Los ácidos grasos se adquirieron de Nu-Check-Prep (Elysian, MN). Material vegetal y condiciones de crecimiento: la cepa Gransden de P. patens (22Ashton N.W. Cove D.J. Mol. Gen. Genet. 1977; 154: 87-95Crossref Scopus (329) Google Scholar). Se cultivaron protonemas de 7 días de edad en medio BCD sólido al que se añadió tartrato de diamonio a 5 mm y se cultivaron a 25 °C bajo luz continua proporcionada por tubos fluorescentes (26Knight C.D. Cove D.J. Cuming A.C. Quatrano R.S. Gilmartin P.M. Bowter C. Molecular Plant Biology. 2. Oxford University Press, Oxford, Nueva York2002: 285-301Google Scholar). Aislamiento y manipulación de ARN: se aisló ARN total a partir de 50 mg de peso fresco de tejido protonémico utilizando el mini kit RNeasy Plant (Qiagen), y se transcribieron de forma inversa 5 μg con el sistema de PCR de transcripción inversa Thermo-Script™ (Invitrogen) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADNc se utilizó como molde para la amplificación por PCR con cebadores. Aislamiento de ADN genómico: aproximadamente 1 g de peso fresco de tejido protonémico se molió a un polvo fino bajo nitrógeno líquido usando un mortero y mano preenfriados. El ADN genómico se extrajo del tejido molido utilizando el kit de extracción de ADN genómico Nucleon™ PhytoPure™ (Amersham Biosciences) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El ADN se recuperó mediante precipitación con etanol y se disolvió en tampón TE (Tris-HCl 10 mm, pH 7,5, EDTA 1 mm). Los cebadores de clonación basados en PCR se sintetizaron en función de los datos de secuencia de NCBI (27Zank T. Bauer J. Cirpus P. Abbadi A. Heinz E. Qiu X. Vrinten P. Sperling P. Domergue F. Meyer A. Kirsch J. PCT. 2005Google Scholar). El cebador directo fue PPFOR1, 5'-ATGGCGCCCCACTCTG-3', y el cebador inverso fue PPREV1, 5'-TCAGCCATCGAGCCGAAACT-3'. La PCR se llevó a cabo en un volumen total de 50 μl. Se utilizaron 10 μm de cada uno de los cebadores para la amplificación por PCR del ADNc transcrito inversamente a partir del ARN total. Después de la desnaturalización inicial a 94 °C durante 4 min, la amplificación se realizó en 35 ciclos de 1 min a 94 °C, 0,5 min a 54 °C y 2,5 min a 72 °C, seguido de una extensión final a 72 °C durante otros 10 min. Los productos de amplificación se fraccionaron en geles de agarosa al 1.0% y se ligaron directamente en pCR®2.1-TOPO® (Invitrogen) y los plásmidos utilizados se transformaron en células de Escherichia coli químicamente competentes One Shot® (Invitrogen). El ADN plasmídico se purificó y secuenció en ambas direcciones con un Abi BigDye V3.1 y un secuenciador automatizado, produciendo el plásmido PPDES5. Análisis funcional: transformación de levadura: el marco de lectura abierto del ADNc de PPDES5 se clonó junto al promotor inducible por galactosa GAL1 del vector de expresión de levadura pYES2 (Invitrogen). Para este propósito, se utilizó la PCR con los cebadores PPFOR1 y PPREV1 que añaden sitios de restricción HindIII y XhoI en los extremos 5'y 3', respectivamente, para amplificar el plásmido PPDES5. El producto de PCR amplificado se ligó en pCR®2.1-TOPO® (Invitrogen) y los plásmidos utilizados se transformaron nuevamente en células de E. coli químicamente competentes One Shot® (Invitrogen). Todo el marco de lectura abierto de la desaturasa se digirió con HindIII/XhoI y se ligó en sitios HindIII/XhoI del vector pYES2 (Invitrogen) para producir el plásmido pYES2-DES5. Su secuencia se verificó mediante secuenciación de ADN. Los plásmidos pYES2-DES5 y pYES2 se transformaron en S. cerevisiae YPH499 (ATCC, Manassas, VA) mediante el kit de transformación S.c. Easy-Comp™ (Invitrogen). Después de la selección de uracilo en placas de agar de medio mínimo, las células que contenían los plásmidos de levadura se cultivaron en medio de uracilo de abandono de mezcla de suplemento completo (CSM-URA) (Krackeler Scientific) que contenía 1.0% (p/v) de rafinosa como la fuente de carbono exclusiva y 0.4% de Tergitol Nonidet P-40 (Sigma) para la solubilización de ácidos grasos. Para los experimentos de expresión génica, los cultivos se cultivaron hasta una densidad óptica (600 nm) de ~0.3 en medio CSM-URA (Krackeler Scientific). La expresión de la región codificante de PPDES5 se indujo mediante la adición de galactosa al 2,0% (p/v). Se añadieron ácidos grasos a 0,7 mm y los cultivos se cultivaron durante 24 h a 28 °C. Interrupción génica dirigida de PPDES5 en P. patens: para la interrupción de PPDES5 por direccionamiento génico, la secuencia codificante de un clon genómico de PPDES5 se reemplazó por un terminador 35S-hph-nos, casete de resistencia a la higromicina (23Cove D.J. Annu. Rev. Genet. 2005; 39: 339-358Crossref PubMed Scopus (164) Google Scholar), de modo que el casete de selección estaba flanqueado por un locus genómico de 1536 y 1234 pares de bases (pb) homólogo a los brazos 5'y 3' de PPDES5, respectivamente (véase la Fig. 2). Se sintetizaron dos pares de cebadores específicos (cebador 1, 5′ -TAGGGCCCCACCCTGTTGCTTCG-3 ′ y cebador 2, 5′ -ATGGGCCCCCAGTTGCTTCGTCCCAG-3 ′; cebador 3, 5′ -ATGTCGACCAGGCAAGTAAATAAGTGA-3 ′ y cebador 4, 5 ′ -ATATGCATGAACGAAAGTAGTCCTGTC-3 ′) en función de la secuencia del genoma de P. patens correspondiente de la base de datos del Instituto Conjunto del Genoma del Departamento de Energía de EE. UU. (ver Fig. 2). Después de la amplificación por PCR con estos cebadores a partir de un molde de ADN genómico de tipo salvaje, los fragmentos de PCR de la longitud esperada (1536 y 1234 pb) se clonaron por separado en el vector pGEM® -TEasy (Promega), se liberaron por digestión con ApaI y SalI/NsiI, respectivamente y luego se ligaron en el vector rr1 que contenía el casete de resistencia a la higromicina. Posteriormente, la construcción de interrupción se digirió con XhoI/HindIII, dando como resultado un fragmento lineal con el casete en su centro flanqueado por secuencias genómicas de 1252 y 554 pb. Este ADN lineal se precipitó y se utilizó para la transformación sin separación del vector. La transferencia directa de ADN mediada por polietilenglicol en protoplastos se realizó como se describe por Schaefer et al. (24Schaefer D. Zryd J.P. Knight C.D. Cove D.J. Mol. Gen. Genet. 1991; 226: 418-424Crossref PubMed Scopus (186) Google Scholar) con modificaciones. Los protonemas se regeneraron durante 7 días en medio sólido que contenía higromicina (25 μg/ml), se transfirieron a medio sin antibiótico durante 7 días y se retransfirieron a medio selectivo durante otros 7 días. Las plantas de fuerte crecimiento que sobrevivieron a este régimen de selección se definieron como transformantes estables. Los eventos de análisis molecular-dirección se analizaron mediante PCR y transferencia Southern. Para este propósito, se extrajo ADN genómico de plantas de tipo salvaje y transgénicas y se confirmó el evento de integración 5'mediante experimentos de PCR con el cebador A (5' -GACCTACCGAACTTTCGA-3 ') correspondiente a la secuencia genómica de P. patens pero 164 pb aguas arriba del extremo 5' del vector de reemplazo y el cebador B (5 '-ACCATCTGTGGGTTAGCGTCC-3') derivado de la región promotora 35S del casete de selección. El evento de integración 3′ también se confirmó mediante PCR con el cebador C (5′ -ATGAAAAAGCCTGAACTACCG-3 ′) derivado del extremo 5′ de la región codificante de hph y el cebador D (5′ -GAACACTCAACTGTAGTAGC-3 ′) correspondiente a la secuencia genómica de P. patens pero 99 pb aguas abajo del extremo 3′ del casete de selección (véase la Fig. 2 para la ubicación de los cebadores). Las PCR se llevaron a cabo en un volumen total de 50 μl. Cada reacción contenía 0.2 μm de cada uno de los cebadores, 200 μm de cada uno de los dNTP, amortiguador de PCR y 2 ml de mezcla de enzimas Elongase® (Invitrogen). Las condiciones de termociclado fueron las siguientes: desnaturalización inicial durante 4 min a 94 °C, seguida de 35 ciclos de 1 min a 94 °C, 0,5 min a 50 °C, 5 min a 72 °C y finalizada mediante una extensión final de 10 min a 72 °C. Para el análisis de transferencia Southern, se digirieron alícuotas de 1 μg de ADN genómico de plantas de tipo salvaje y transgénicas con las enzimas de restricción apropiadas y se separaron en una electroforesis en gel de agarosa al 0,6%. Los pasos de lavado final se realizaron en 0.1× SSC con SDS al 0.1% a 65 °C. La detección se realizó con un sustrato quimioluminiscente (CSPD; Roche Applied Science). Expresión génica transitoria de PPDES5-Los cebadores con PPFOR2, 5'-CACCATGGCGCCCCACTCTG-3', y PPREV2, 5'-TCAAGACCAGCCGCTCGCATCTTTCCAAGAGCCATCGAGCCGAAACT-3', se utilizaron para la amplificación por PCR de pYES2-DES5 con KlentaqLA. 5Patentado por W. Barnes. Las PCR se llevaron a cabo en un volumen total de 50 μl. Cada reacción contiene 0.4 μm de cada uno de los cebadores, 100 μm de cada uno de los dNTP, amortiguador de PCR, 1.5 mm MgCl2 y 0.5 μlof KlentaqLA.5 Las condiciones de termociclado fueron las siguientes: desnaturalización inicial durante 4 min a 94 °C seguido de 28 ciclos de 1 min a 94 °C, 0.5 min a 54 °C, 2.5 min a 72 °C y finalizado por una extensión final de 10 min a 72 °C. Los productos de amplificación se incorporaron directamente en el vector pENTR™/D-TOPO® (Invitrogen). El plásmido de recombinación resultante tiene la secuencia PPDES5 flanqueada por secuencias de recombinación attL. Luego se recombinó con sitios attR utilizando la mezcla enzimática Gateway® LR Clonase™ II (Invitrogen). Esta reacción transfirió la secuencia PPDES5 a un vector de destino deseado (tk1). El vector de destino que contiene un gen, PPDES5, impulsado por el promotor 35S, se transformó en protoplastos de la cepa objetivo (24Schaefer D. Zryd J.P. Knight C.D. Cove D.J. Mol. Gen. Genet. 1991; 226: 418-424Crossref PubMed Scopus (186) Google Scholar). Los protoplastos regenerados se cultivaron en medio BCD líquido complementado con tartrato de diamonio 5 mm y manitol al 6% durante 2 días antes del análisis de ácidos grasos. Análisis de ácidos grasos: se analizaron los ácidos grasos totales extraídos de cultivos de levadura y musgo mediante cromatografía de gases (GC) de ésteres metílicos. Los lípidos del tejido de levadura y musgo se transmetilaron con metóxido de sodio al 1% en metanol y ácido sulfúrico al 2,5% en metanol, respectivamente, a 85 °C durante 30 min. Los ésteres metílicos de ácidos grasos (Fame) se extrajeron luego en heptano. El análisis de GC de los Fame se realizó utilizando un cromatógrafo de gases de la serie Agilent 6890N equipado con una columna capilar HP-INNOWax de 0.25 mm × 30 m × 0.25 mm y un detector de ionización de llama. Los ácidos grasos se identificaron por comparación con los tiempos de retención de los estándares. Los porcentajes relativos de los ácidos grasos se estimaron a partir de las áreas de los picos. Los ácidos grasos correspondientes se caracterizaron adicionalmente en un derivado de dietilamida mediante cromatografía de gases-espectrometría de masas usando la serie Agilent 6890N que funciona a un voltaje de ionización de 70 eV con un intervalo de barrido de 50-500 Da. Clonación de una desaturasa unida a la membrana de P. patens: el musgo P. patens ha recibido atención debido a su capacidad para producir varios PUFA, incluidos ARA (20:4 Δ5,8,11,14) y EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17) (8Grimsley N.H. Grimsley J.M. Hartmann E. Phytochemistry. 1981; 20: 1519-1524 Crossref Scopus (24) Google Scholar). Por lo tanto, estábamos interesados en la información molecular subyacente a la biosíntesis de estos ácidos grasos. Para identificar un gen que codifica la desaturasa involucrada en el paso final de la biosíntesis de ARA (20:4 Δ5,8,11,14) y EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17), se realizaron búsquedas en la base de datos del NCBI en P. patens y se utilizó la secuencia identificada en función de su identidad limitada con otras Δ5-desaturasas (27Zank T. Bauer J. Cirpus P. Abbadi A. Heinz E. Qiu X. Vrinten P. Sperling P. Domergue F. Meyer A. Kirsch J. PCT. 2005Google Scholar). El ADNc del ARNm transcrito de forma inversa del tejido protonémico de 7 días de edad de P. patens se amplificó mediante PCR. Se clonó y secuenció un producto de amplificación que contenía la longitud esperada. El marco de lectura abierto del ADNc de PPDES5 es de 1443 pb desde un inicio ATG hasta un codón de terminación TGA y codifica 480 aminoácidos con una masa molecular de 54.3 kDa. Las búsquedas y alineaciones del banco de datos con esta secuencia indicaron similitud con acil-lípido desaturasas del residuo 190-454, con un dominio similar al citocromo b5 en el extremo N del residuo 36-107. La comparación de secuencias de aminoácidos utilizando el programa ClustalW reveló que el PPDES5 tiene la homología más fuerte con la Δ5-desaturasa de la hepática Marchantia polymorpha (66% de identidad) (28Kajikawa M. Yamato K.T. Kohzu Y. Nojiri M. Sakuradani E. Shimizu S. Sakai Y. Fukuzawa H. Ohyama K. Plant Mol. Biol. 2004; 54: 335-352Crossref PubMed Scopus (51) Google Scholar) y también comparte 36% de identidad con Δ5-desaturasa de Dictyostelium discoideum (29Saito T. Morio T. Ochiai H. Eur. J. Biochem. 2000; 267: 1813-1818Crossref PubMed Scopus (22) Google Scholar, 30Saito T. Ochiai H. Eur. J. Biochem. 1999; 265: 809-814Crossref PubMed Scopus (17) Google Scholar) y Mortierella alpina (31Michaelson L.V. Lazarus C.M. Griffiths G. Napier J.A. Stobart A.K. J. Biol. Chem. 1998; 273: 19055-19059Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (142) Google Scholar), que se requiere para la desaturación de AGPI. La alineación con esas secuencias indica que la homología se produce principalmente en el dominio similar al citocromo b5 que sirve como donante de electrones (enmarcado con líneas discontinuas en la Fig. 3) y en las tres áreas conservadas con motivos ricos en histidina (enmarcadas en la Fig. 3). El dominio relacionado con el citocromo b5 contenía los ocho residuos invariantes típicos de la superfamilia del citocromo b5 (marcados con asteriscos en la Fig. 3) y la presencia de una región de unión a hemo caracterizada por el motivo HPGG hacia el extremo N (32Lederer F. Biochimie (París). 1994; 76: 674-692 Crossref PubMed Scopus (88) Google Scholar). Se requiere un donante de electrones que contenga hemo para la desaturación de ácidos grasos, y el citocromo b5 cumple esta función para la desaturasa unida a la membrana (16Smith M.A. Cross A.R. Jones O.T.G. Griffiths W.T. Stymne S. Stobart A.K. Biochem. J. 1990; 272: 23-29Crossref PubMed Scopus (86) Google Scholar, 33Mitchell A.G. Martin C.E. J. Biol. Chem. 1995; 270: 29766-29772Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (130) Google Scholar, 34Smith M.A. Jonsson L. Stymne S. Stobart A.K. Biochem. J. 1992; 287: 141-144Crossref PubMed Scopus (64) Google Scholar). Por lo tanto, se puede considerar que toda la secuencia codifica una proteína de fusión que consiste en un citocromo b5 N-terminal y una desaturasa. El motivo de secuencia QIEHH de la tercera caja de histidina comienza con una glutamina en lugar de una histidina (marcada con un triángulo en la Fig. 3), que es la característica de las desaturasas frontales, pero no se encuentra en otras desaturasas como las Δ12- y Δ15-desaturasas (35Sayanova O. Beaudoin F. Libisch B. Castel A. Shewry P.R. Napier J.A. J. Exp. Bot. 2001; 52: 1581-1585Crossref PubMed Scopus (61) Google Scholar, 36Sayanova O. Beaudoin F. Libisch B. Shewry P.R. Napier J.A. Biochem. Soc. Trans. 2000; 28: 636-638Crossref PubMed Google Scholar, 37Sperling P. Heinz E. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2001; 103: 158-180 Crossref Scopus (59) Google Scholar). El análisis funcional de PPDES5 en la figura 4 de levadura muestra los resultados del análisis de GC de los ésteres metílicos de ácidos grasos de cepas de levadura, transformados con la construcción de expresión de PPDES5 como se describe en "Procedimientos experimentales", a los que se habían suministrado sustratos de ácidos grasos. Un pico adicional es evidente en la traza obtenida de pYES2-DES5 inducido cultivado en presencia de ácido di-homo-γ-linolénico (DHGLA) (20:3 Δ8,11,14) en comparación con un control de vector vacío. El tiempo de retención del pico adicional fue idéntico al del éster metílico de ARA auténtico (20:4 Δ5,8,11,14). Este compuesto también mostró un ion molecular de 318 m/z (el ion molecular esperado para metil ARA), así como un patrón de fragmentación idéntico al del auténtico éster metílico de ARA. La identidad de este compuesto se verificó adicionalmente mediante la obtención del derivado de dietilamida con el fin de producir un espectro de masas específico de la estructura. Como se muestra en la Fig. 5, el espectro de masas del compuesto derivatizado contenía un ion molecular de 359 m/z y un perfil de fragmentación consistente con el derivado de dietilamida ARA. Por lo tanto, las células de levadura transformadas con el plásmido pYES2-DES5 habían adquirido actividad Δ5-desaturasa específica funcional y ahora eran capaces de sintetizar ARA (20:4 Δ5,8,11,14) a partir del sustrato DHGLA (20:3 Δ8,11,14). La Δ5-desaturasa específica en la levadura transformada pareció ser un catalizador eficiente, con un 14,7% del sustrato convertido en ARA en las condiciones de los experimentos. Análisis de espectrometría de masas FIGURE 5GC del derivado de dietilamida del nuevo pico identificado en levadura portadora de pYES2-DES5 en presencia de DHGLA (20:3 Δ8,11,14). Se muestra una comparación de los espectros de masas del nuevo pico (A) y un estándar auténtico de ARA (20:4 Δ5,8,11,14) (B).Ver figura de imagen grande VisorDescargar imagen de alta resolución Descargar (PPT) Para probar si la Δ5-desaturasa de P. patens era capaz de desaturar otros sustratos, los cultivos de levadura que expresan PPDES5 se complementaron con varios ácidos grasos (Tabla 1). No pudimos detectar ningún pico nuevo cuando se alimentaron ácidos grasos C18 y C22 a la levadura; sin embargo, cuando se proporcionaron 20:2 Δ11,14 y 20:3 Δ11,14,17 como sustratos, detectamos picos nuevos con espectros de masas consistentes con los de metilo 20:3 Δ5,11,14 (13.5%) y 20:4 Δ5,11,14,17 (14.5%), respectivamente (datos no mostrados). Por lo tanto, la Δ5-desaturasa de P. patens parece ser específica para los ácidos grasos C20. Además, pudimos excluir la actividad de Δ8-desaturasa porque no pudimos detectar ningún sustrato de 20:3 Δ8,11,14 o 20:4 Δ8,11,14,17 de 20:2 Δ11,14 y 20:3 Δ11,14,17, respectivamente. Tabla 1Especificidad de sustrato de ácido graso de P. patens Δ5-desaturasa (PPDES5) Las células de levadura transformadas con pYES2-DES5 se complementaron con diferentes ácidos grasos. Los Fame de lípidos totales en condiciones inductoras se analizaron por GC, utilizando detección de ionización de llama. La conversión se calculó como (producto × 100)/(sustrato + producto) utilizando valores correspondientes a las áreas de los picos de las señales correspondientes. Cada valor es la media ± DE de tres experimentos independientes.Sustratos de ácidos grasosPorcentaje de sustrato convertido18:2 (Δ9,12), ácido ω-6 linoleico0,0 ± 0,018:3 (Δ9,12,15), ácido ω-3 α-linoleico0,0 ± 0,020:2 (Δ11,14), ácido ω-6 eicosadienoico13,5 ± 0,320:3 (Δ8,11,14), ω-6 DHGLA14,7 ± 0,520:3 (Δ11,14,17), ω-3 ETA14,5 ± 0,322:4 (Δ7,10,13,16), ácido ω-6 adrenal0,0 ± 0,022:5 (Δ7,10,13,16,19), ácido ω-3 docosapentaenoico0,0 ± 0,0 Tabla abierta en una nueva pestaña Perfil de ácidos grasos en P. patens de tipo silvestre-Several ω-6 y ácidos grasos ω-3 se detectaron en tejido silvestre, incluyendo ácidos grasos C16-20 saturados, mono- y poliinsaturados (Fig. 6). El principal ácido graso detectado fue ARA (20:4 Δ5,8,11,14), que es el producto de Δ5-desaturación de DHGLA (20:3 Δ8,11,14) en la vía ω-6 (ver Fig. 1). Sin embargo, a partir de nuestros experimentos pudimos detectar muy poco ácido ω-3 eicosatetraenoico (ETA) (20:4 Δ8,11,14,17) a pesar de la presencia de su producto de Δ5-desaturación, EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17). Reemplazo de genes dirigidos: para una prueba alternativa de la función de PPDES5, analizamos los ácidos grasos totales de tipo silvestre y las tres líneas transgénicas estables (K1-3) que tienen la secuencia codificante de PPDES5 reemplazada por un casete de selección (Fig. 6). En contraste con el tipo salvaje, las líneas transgénicas carecían de los ácidos grasos insaturados ARA (20:4 Δ5,8,11,14) y EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17), productos del paso de Δ5-desaturación, y un claro aumento en el nivel de su sustrato DHGLA (20:3 Δ8,11,14) y ETA (20:4 Δ8,11,14,17), respectivamente. Análisis molecular de las líneas transgénicas: la integración específica del ADN transformado en el gen PPDES5 se analizó mediante PCR utilizando ADN genómico de las tres líneas transgénicas (K1-3) y el tipo salvaje. Las ubicaciones de los diferentes cebadores se presentan en la Fig. 2. El extremo 5'del cebador A y el extremo 3' del cebador D se unen 164 pb cadena arriba y 99 pb cadena abajo de las secuencias genómicas 5'y 3' que flanquean el casete de selección, excluyendo así las señales de PCR resultantes de la contaminación por ADN utilizado para la transformación. PCR con par de cebadores A/B amplificado a fr

The moss Physcomitrella patens contains high levels of arachidonic acid and lesser amounts of eicosapentaenoic acid. Here we report the identification and characterization of a Δ5-desaturase from P. patens that is associated with the synthesis of these fatty acids. A full-length cDNA for this desaturase was identified by data base searches based on homology to sequences of known Δ5-desaturase cDNAs from fungal and algal species. The resulting P. patens cDNA encodes a 480-amino acid polypeptide that contains a predicted N-terminal cytochrome b5-like domain as well as three histidine-rich domains. Expression of the enzyme in Saccharomyces cerevisiae resulted in the production of the Δ5-containing fatty acid arachidonic acid in cells that were provided di-homo-γ-linolenic acid. In addition, the expressed enzyme generated Δ5-desaturation products with the C20 substrates ω-6 eicosadienoic and ω-3 eicosatrienoic acids, but no products were detected with the C18 fatty acid linoleic and α-linolenic acids or with the C22 fatty acid adrenic and docosapentaenoic acids. When the corresponding P. patens genomic sequence was disrupted by replacement through homologous recombination, a dramatic alteration in the fatty acid composition was observed, i.e. an increase in di-homo-γ-linolenic and eicosatetraenoic acids accompanied by a concomitant disappearance of the Δ5-fatty acid arachidonic and eicosapentaenoic acids. In addition, overexpression of the P. patens cDNA in protoplasts isolated from a disrupted line resulted in the restoration of arachidonic acid synthesis. The moss Physcomitrella patens contains high levels of arachidonic acid and lesser amounts of eicosapentaenoic acid. Here we report the identification and characterization of a Δ5-desaturase from P. patens that is associated with the synthesis of these fatty acids. A full-length cDNA for this desaturase was identified by data base searches based on homology to sequences of known Δ5-desaturase cDNAs from fungal and algal species. The resulting P. patens cDNA encodes a 480-amino acid polypeptide that contains a predicted N-terminal cytochrome b5-like domain as well as three histidine-rich domains. Expression of the enzyme in Saccharomyces cerevisiae resulted in the production of the Δ5-containing fatty acid arachidonic acid in cells that were provided di-homo-γ-linolenic acid. In addition, the expressed enzyme generated Δ5-desaturation products with the C20 substrates ω-6 eicosadienoic and ω-3 eicosatrienoic acids, but no products were detected with the C18 fatty acid linoleic and α-linolenic acids or with the C22 fatty acid adrenic and docosapentaenoic acids. When the corresponding P. patens genomic sequence was disrupted by replacement through homologous recombination, a dramatic alteration in the fatty acid composition was observed, i.e. an increase in di-homo-γ-linolenic and eicosatetraenoic acids accompanied by a concomitant disappearance of the Δ5-fatty acid arachidonic and eicosapentaenoic acids. In addition, overexpression of the P. patens cDNA in protoplasts isolated from a disrupted line resulted in the restoration of arachidonic acid synthesis. Polyunsaturated fatty acids (PUFAs), 4The abbreviations used are: PUFA, polyunsaturated fatty acid; ARA, arachidonic acid; EPA, eicosapentaenoic acid; GC, gas chromatography; FAME, fatty acid methyl ester; DHGLA, di-homo-γ-linolenic acid; ETA, eicosatetraenoic acid or eicosatrienoic acid.4The abbreviations used are: PUFA, polyunsaturated fatty acid; ARA, arachidonic acid; EPA, eicosapentaenoic acid; GC, gas chromatography; FAME, fatty acid methyl ester; DHGLA, di-homo-γ-linolenic acid; ETA, eicosatetraenoic acid or eicosatrienoic acid. fatty acids containing 18 or more carbon atoms with two or more methylene-interrupted double bonds in the cis-position, have received increasing attention in recent years because they are considered to have beneficial effects on human health and development when included in the diet (1Horrocks L.A. Yeo Y.K. Pharmacol. Res. 1999; 40: 211-225Crossref PubMed Scopus (749) Google Scholar, 2Uauy R. Mena P. Wegher B. Nieto S. Salem Jr., N. Pediatr. Res. 2000; 47: 127-135Crossref PubMed Scopus (194) Google Scholar). Long-chain PUFAs (≥C20) are not commonly found in angiosperms; however, they are present in some gymnosperms (3Wolff R.L. Pedrono F. Pasquier E. Marpeau A.M. Lipids. 2000; 35: 1-22Crossref PubMed Scopus (80) Google Scholar). High proportions of PUFA accumulation are found in many algae, mosses, and ferns (4Ackman R.G. Tocher C.S. McLachlan J. J. Fish Res. Bd. Can. 1968; 25: 1603-1620Crossref Google Scholar, 5Dembitsky V.M. Prog. Lipid. Res. 1993; 32: 281-356Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar, 6Jamieson G.R. Reid E.H. Phytochemistry. 1975; 14: 2229-2232Crossref Scopus (26) Google Scholar). The function of these long-chain PUFAs in the membranes of lower plants is still unclear, whereas in humans they play a role in eicosanoid metabolism (7Samuelsson B. Science. 1983; 220: 568-575Crossref PubMed Scopus (2307) Google Scholar). The moss Physcomitrella patens (Hedw.) B. S. G. (Funariales, Bryophyta) contains high proportions of arachidonic acid (ARA) (20:4 Δ5,8,11,14) and some eicosapentaenoic acid (EPA) (20:5 Δ5,8,11,14,17) (8Grimsley N.H. Grimsley J.M. Hartmann E. Phytochemistry. 1981; 20: 1519-1524Crossref Scopus (24) Google Scholar). In mammals, ARA (20:4 Δ5,8,11,14) and EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17) are precursors of the short-lived regulatory molecules, the eicosanoids, that comprise the prostaglandins, the leukotrienes, and the thromboxanes (9Horrobin D.F. Prog. Lipid. Res. 1992; 31: 163-194Crossref PubMed Scopus (414) Google Scholar, 10Sayanova O.V. Napier J.A. Phytochemistry. 2004; 65: 147-158Crossref PubMed Scopus (136) Google Scholar, 11Roynette C.E. Calder P.C. Dupertuis Y.M. Pichard C. Clin. Nutr. 2004; 23: 139-151Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (219) Google Scholar). These compounds act locally through autocrine or paracrine process on G-protein-linked cell surface receptors. This leads to the activation of various signaling mechanisms that have effects on numerous cellular functions including chemotaxis, vascular permeability, inflammation, vasoconstriction, regulation of the immune system, blood clotting, neurotransmission, and cholesterol metabolism (12Jump D.B. J. Biol. Chem. 2002; 277: 8755-8758Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (497) Google Scholar, 13Funk C.D. Science. 2001; 294: 1871-1875Crossref PubMed Scopus (2966) Google Scholar, 14Horrobin D.F. Rev. Contemp. Pharmacother. 1990; 1: 1-45Google Scholar). ARA (20:4 Δ5,8,11,14) and EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17) are converted from linoleic acid (18:2 Δ9,12) and α-linolenic acid (18:3 Δ9,12,15), respectively, by the activities of Δ6-desaturase, Δ6-elongase, and Δ5-desaturase. This reaction series is designated the ω-6 pathway for ARA (20:4 Δ5,8,11,14) synthesis and the ω-3 pathway for EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17) synthesis (see Fig. 1). The desaturases are thought to function like other microsomal desaturases from higher plants and yeast, catalyzing aerobic reactions requiring cytochrome b5 as a cofactor. Electrons are transferred from NADH-dependent cytochrome b5 reductase via the heme-containing cytochrome b5 molecule to the fatty acid desaturase (15Dailey H.A. Strittmatter P. J. Biol. Chem. 1980; 255: 5184-5189Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 16Smith M.A. Cross A.R. Jones O.T.G. Griffiths W.T. Stymne S. Stobart A.K. Biochem. J. 1990; 272: 23-29Crossref PubMed Scopus (86) Google Scholar, 17Pereira S.L. Leonard A.E. Mukerji P. Prostaglandins Leukotrienes Essent. Fatty Acids. 2003; 68: 97-106Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (181) Google Scholar, 18Wallis J.G. Watt J.L. Browse J. Trends Biochem. Sci. 2002; 27: 467-473Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (264) Google Scholar). However, biochemical characterization of membrane-bound desaturases has been limited because they are difficult to purify due to their membrane association. Analysis of the predicted protein sequences for the higher plant desaturases together with those from cyanobacteria, yeast, and mammals revealed the presence of eight highly conserved histidine residues (19Shanklin J. Whittle E. Fox D.C. Biochemistry. 1994; 33: 12787-12794Crossref PubMed Scopus (638) Google Scholar). Because the moss P. patens can produce high proportions of ARA (20:4 Δ5,8,11,14) and some EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17) (8Grimsley N.H. Grimsley J.M. Hartmann E. Phytochemistry. 1981; 20: 1519-1524Crossref Scopus (24) Google Scholar), it can serve as a model for studying the mechanism underlying the biosynthesis of PUFAs. Only the genes encoding the Δ6-desaturase and Δ6-elongase have so far been cloned from this organism (20Girke T. Schmidt H. Zahringer U. Reski R. Heinz E. Plant J. 1998; 15: 39-48Crossref PubMed Scopus (169) Google Scholar, 21Zank T.K. Zahringer U. Beckmann C. Pohnert G. Boland W. Holtorf H. Reski R. Lerchl J. Heinz E. Plant J. 2002; 31: 255-268Crossref PubMed Scopus (90) Google Scholar). However, the P. patens genes encoding Δ5-desaturase that catalyze the following step in the PUFAs biosynthesis have not yet been functionally identified. This moss can be vegetatively propagated in the haploid state (22Ashton N.W. Cove D.J. Mol. Gen. Genet. 1977; 154: 87-95Crossref Scopus (329) Google Scholar, 23Cove D.J. Annu. Rev. Genet. 2005; 39: 339-358Crossref PubMed Scopus (164) Google Scholar), which simplifies the phenotypic analysis after mutation or transformation (24Schaefer D. Zryd J.P. Knight C.D. Cove D.J. Mol. Gen. Genet. 1991; 226: 418-424Crossref PubMed Scopus (186) Google Scholar). Genes can be specifically inactivated by targeted gene replacement, which occurs at high frequency in P. patens (23Cove D.J. Annu. Rev. Genet. 2005; 39: 339-358Crossref PubMed Scopus (164) Google Scholar, 25Kamisugi Y. Cuming A.C. Cove D.J. Nucleic Acids Res. 2005; 33: e173Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar). In the present study, a Δ5-desaturase associated with the biosynthesis of ARA (20:4 Δ5,8,11,14) and EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17) in P. patens was functionally identified by heterologous expression in Saccharomyces cerevisiae, by targeted disruption of the corresponding gene, and by transient expression in the gene disrupted line. Materials—Restriction enzymes, polymerases, and DNA-modifying enzymes were obtained from New England Biolabs unless indicated otherwise. All other chemicals used were reagent grade from Sigma. Fatty acids were purchased from Nu-Check-Prep (Elysian, MN). Plant Material and Growth Conditions—The Gransden strain of P. patens (22Ashton N.W. Cove D.J. Mol. Gen. Genet. 1977; 154: 87-95Crossref Scopus (329) Google Scholar) was used throughout the studies. 7-day-old protonemata were grown on solid BCD medium to which di-ammonium tartrate was added to 5 mm and cultured at 25 °C under continuous light provided by fluorescent tubes (26Knight C.D. Cove D.J. Cuming A.C. Quatrano R.S. Gilmartin P.M. Bowter C. Molecular Plant Biology. 2. Oxford University Press, Oxford, New York2002: 285-301Google Scholar). RNA Isolation and Manipulation—Total RNA was isolated from 50 mg of fresh weight of protonemal tissue using the RNeasy Plant mini kit (Qiagen), and 5 μg was reversed transcribed with the Thermo-Script™ reverse transcription PCR system (Invitrogen) according to the manufacturer's instructions. The cDNA was used as a template for PCR amplification with primers. Genomic DNA Isolation—Approximately 1 g of fresh weight of protonemal tissue was ground to a fine powder under liquid nitrogen using a pre-cooled mortar and pestle. Genomic DNA was extracted from the ground tissue using the Nucleon™ PhytoPure™ genomic DNA extraction kit (Amersham Biosciences) according to the manufacturer's instructions. DNA was recovered by ethanol precipitation and dissolved in TE buffer (10 mm Tris-HCl, pH 7.5, 1 mm EDTA). PCR-based Cloning—Primers were synthesized based on NCBI sequence data (27Zank T. Bauer J. Cirpus P. Abbadi A. Heinz E. Qiu X. Vrinten P. Sperling P. Domergue F. Meyer A. Kirsch J. PCT. 2005Google Scholar). The forward primer was PPFOR1, 5′-ATGGCGCCCCACTCTG-3′, and the reverse primer was PPREV1, 5′-TCAGCCATCGAGCCGAAACT-3′. The PCR was carried out in a total volume of 50 μl. 10 μm each of the primers were used for PCR amplification of cDNA reversed transcribed from total RNA. After initial denaturation at 94 °C for 4 min, amplification was performed in 35 cycles of 1 min at 94 °C, 0.5 min at 54 °C, and 2.5 min at 72 °C, followed by a final extension at 72 °C for another 10 min. Amplification products were fractionated on 1.0% agarose gels and directly ligated into pCR®2.1-TOPO® (Invitrogen) and the plasmids used were transformed into One Shot® Chemically competent Escherichia coli cells (Invitrogen). Plasmid DNA was purified and sequenced in both directions with an ABI BigDye V3.1 and an automated sequencer, yielding the plasmid PPDES5. Functional Analysis: Yeast Transformation—The open reading frame of the PPDES5 cDNA was cloned next to the GAL1 galactose-inducible promoter of the yeast expression vector pYES2 (Invitrogen). For this purpose, PCR with the PPFOR1 and PPREV1 primers that add HindIII and XhoI restriction sites at the 5′- and 3′-ends, respectively, was used to amplify the plasmid PPDES5. The amplified PCR product was ligated into pCR®2.1-TOPO® (Invitrogen) and the plasmids used were transformed into One Shot® Chemically competent E. coli cells (Invitrogen) again. The entire open reading frame of the desaturase was digested with HindIII/XhoI and ligated into HindIII/XhoI sites of the pYES2 vector (Invitrogen) to yield plasmid pYES2-DES5. Its sequence was verified by DNA sequencing. The plasmids pYES2-DES5 and pYES2 were transformed into the S. cerevisiae YPH499 (ATCC, Manassas, VA) by S.c. Easy-Comp™ transformation kit (Invitrogen). After uracil selection on minimal medium agar plates, cells containing the yeast plasmids were cultivated in complete supplement mixture dropout uracil medium (CSM-URA) (Krackeler Scientific) containing 1.0% (w/v) raffinose as the exclusive carbon source and 0.4% Tergitol Nonidet P-40 (Sigma) for the solubilization of fatty acids. For gene expression experiments, the cultures were grown to an optical density (600 nm) of ∼0.3 in CSM-URA medium (Krackeler Scientific). Expression of the PPDES5 coding region was induced by the addition of galactose to 2.0% (w/v). Fatty acids were added to 0.7 mm and cultures grown for 24 h at 28 °C. Targeted Gene Disruption of PPDES5 in P. patens—For disruption of PPDES5 by gene targeting, the coding sequence of a genomic clone of PPDES5 was replaced by a 35S-hph-nos terminator, hygromycin-resistance cassette (23Cove D.J. Annu. Rev. Genet. 2005; 39: 339-358Crossref PubMed Scopus (164) Google Scholar), so that the selection cassette was flanked by 1536 and 1234 base pairs (bp) genomic locus homologous to 5′- and 3′-arms of PPDES5, respectively (see Fig. 2). Two specific primer pairs (Primer 1, 5′-TAGGGCCCCACCCTGTTGCTTCG-3′, and Primer 2, 5′-ATGGGCCCCCAGTTGCTTCGTCCCAG-3′; Primer 3, 5′-ATGTCGACCAGGCAAGTAAATAAGTGA-3′, and Primer 4, 5′-ATATGCATGAACGAAAGTAGTCCTGTC-3′) were synthesized based on the corresponding P. patens genome sequence from the U.S. Department of Energy Joint Genome Institute data base (see Fig. 2). After PCR amplification with these primers from a wild-type genomic DNA template, the PCR fragments of the expected length (1536 and 1234 bp) were separately cloned into pGEM®-TEasy vector (Promega), released by digestion with ApaI and SalI/NsiI, respectively and then ligated into rr1 vector containing hygromycin-resistance cassette. Subsequently, the disruption construct was digested with XhoI/HindIII, resulting in a linear fragment with the cassette in its center flanked by genomic sequences of 1252 and 554 bp. This linear DNA was precipitated and used for the transformation without separation from the vector. Polyethylene lycol-mediated direct DNA transfer into protoplasts was performed as described by Schaefer et al. (24Schaefer D. Zryd J.P. Knight C.D. Cove D.J. Mol. Gen. Genet. 1991; 226: 418-424Crossref PubMed Scopus (186) Google Scholar) with modifications. The protonemata were regenerated for 7 days on solid medium containing hygromycin (25 μg/ml), transferred to medium without antibiotic for 7 days, and retransferred to selective medium for a further 7 days. Strongly growing plants that survived this selection regimen were defined as stable transformants. Molecular Analysis—Targeting events were analyzed by PCR and Southern blotting. For this purpose, genomic DNA of wild-type and transgenic plants was extracted and the 5′-integration event was confirmed by PCR experiments with primer A (5′-GACCTACCGAACTTTCGA-3′) corresponding to genomic sequence of P. patens but 164 bp upstream of the 5′-end of replacement vector and primer B (5′-ACCATCTGTGGGTTAGCGTCC-3′) derived from the 35S promoter region of the selection cassette. The 3′-integration event was also confirmed by PCR with primer C (5′-ATGAAAAAGCCTGAACTACCG-3′) derived from the 5′-end of the hph coding region and primer D (5′-GAACACTCAACTGTAGTAGC-3′) corresponding to genomic sequence of P. patens but 99 bp downstream of the 3′-end of the selection cassette (see Fig. 2 for location of primers). PCRs were carried out in a total volume of 50 μl. Each reaction contained 0.2 μm each of the primers, 200 μm each of the dNTPs, PCR buffer, and 2 ml of Elongase® enzyme mix (Invitrogen). The thermocycling conditions were as follows: initial denaturation for 4 min at 94 °C, followed by 35 cycles of 1 min at 94 °C, 0.5 min at 50 °C, 5 min at 72 °C, and terminated by a 10-min final extension at 72 °C. For Southern blot analysis, 1-μg aliquots of genomic DNA from wild-type and transgenic plants were digested with the appropriate restriction enzymes and separated on a 0.6% agarose gel electrophoresis. The final washing steps were performed in 0.1× SSC with 0.1% SDS at 65 °C. Detection was accomplished with a chemiluminescent substrate (CSPD; Roche Applied Science). Transient Gene Expression of PPDES5—The primers with PPFOR2, 5′-CACCATGGCGCCCCACTCTG-3′, and PPREV2, 5′-TCAAGACCAGCCGCTCGCATCTTTCCAAGAGCCATCGAGCCGAAACT-3′, were used for PCR amplification of pYES2-DES5 with KlentaqLA. 5Patented by W. Barnes. PCRs were carried out in a total volume of 50 μl. Each reaction contains 0.4 μm each of primers, 100 μm each of dNTPs, PCR buffer, 1.5 mm MgCl2, and 0.5 μlof KlentaqLA.5 The thermocycling conditions were as follows: initial denaturation for 4 min at 94 °C followed by 28 cycles of 1 min at 94 °C, 0.5 min at 54 °C, 2.5 min at 72 °C, and terminated by a 10-min final extension at 72 °C. Amplification products were incorporated directly into pENTR™/D-TOPO® vector (Invitrogen). The resulting recombination plasmid has the PPDES5 sequence flanked by attL recombination sequences. It was then recombined with attR sites using the Gateway® LR Clonase™ II Enzyme Mix (Invitrogen). This reaction transferred the PPDES5 sequence into a desired destination vector (tk1). Destination vector containing a gene, PPDES5, driven by the 35S promoter, was transformed into protoplasts of the targeted strain (24Schaefer D. Zryd J.P. Knight C.D. Cove D.J. Mol. Gen. Genet. 1991; 226: 418-424Crossref PubMed Scopus (186) Google Scholar). The regenerated protoplasts were cultured in liquid BCD medium supplemented with 5 mm di-ammonium tartrate and 6% mannitol for 2 days before fatty acid analysis. Fatty Acid Analysis—Total fatty acids extracted from yeast and moss cultures were analyzed by gas chromatography (GC) of methyl esters. Lipids from yeast and moss tissue were transmethylated with 1% sodium methoxide in methanol and 2.5% sulfuric acid in methanol, respectively, at 85 °C for 30 min. Fatty acid methyl esters (FAMEs) were then extracted in heptane. GC analysis of FAMEs was conducted using an Agilent 6890N Series gas chromatograph equipped with a 0.25 mm × 30 m × 0.25 mm HP-INNOWax capillary column and a flame ionization detector. Fatty acids were identified by comparison with retention times of standards. Relative percentages of the fatty acids were estimated from peak areas. The corresponding fatty acids were further characterized on diethylamide derivative by gas chromatography-mass spectrometry using the Agilent 6890N Series operating at an ionization voltage of 70 eV with a scan range of 50-500 Da. Cloning of a P. patens Membrane-bound Desaturase—The moss P. patens has received attention because of its ability to produce several PUFAs, including ARA (20:4 Δ5,8,11,14) and EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17) (8Grimsley N.H. Grimsley J.M. Hartmann E. Phytochemistry. 1981; 20: 1519-1524Crossref Scopus (24) Google Scholar). We were therefore interested in the molecular information underlying the biosynthesis of these fatty acids. To identify a gene coding for the desaturase involved in the final step of ARA (20:4 Δ5,8,11,14) and EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17) biosynthesis, NCBI data base searches in P. patens were conducted and the sequence identified based on its limited identity with other Δ5-desaturases was used (27Zank T. Bauer J. Cirpus P. Abbadi A. Heinz E. Qiu X. Vrinten P. Sperling P. Domergue F. Meyer A. Kirsch J. PCT. 2005Google Scholar). cDNA from reverse-transcribed mRNA from 7-day-old protonemal tissue of P. patens was amplified by PCR. An amplification product containing the expected length was cloned and sequenced. The open reading frame of the PPDES5 cDNA is 1443 bp from an ATG start to a TGA stop codon and codes for 480 amino acids with a molecular mass of 54.3 kDa. Data bank searches and alignments with this sequence indicated similarity with acyl-lipid desaturases from residue 190-454, with a cytochrome b5-like domain in the N terminus from residue 36-107. Amino acid sequence comparison using the ClustalW program revealed the PPDES5 has the strongest homology to Δ5-desaturase from the liverwort Marchantia polymorpha (66% identity) (28Kajikawa M. Yamato K.T. Kohzu Y. Nojiri M. Sakuradani E. Shimizu S. Sakai Y. Fukuzawa H. Ohyama K. Plant Mol. Biol. 2004; 54: 335-352Crossref PubMed Scopus (51) Google Scholar) and also shares 36% identity with Δ5-desaturase from Dictyostelium discoideum (29Saito T. Morio T. Ochiai H. Eur. J. Biochem. 2000; 267: 1813-1818Crossref PubMed Scopus (22) Google Scholar, 30Saito T. Ochiai H. Eur. J. Biochem. 1999; 265: 809-814Crossref PubMed Scopus (17) Google Scholar) and Mortierella alpina (31Michaelson L.V. Lazarus C.M. Griffiths G. Napier J.A. Stobart A.K. J. Biol. Chem. 1998; 273: 19055-19059Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (142) Google Scholar), which is required for the desaturation of PUFAs. Alignment with those sequences indicates that homology occurs mainly in the cytochrome b5-like domain that serves as an electron donor (boxed with broken lines in Fig. 3) and in the three conserved histidine-rich motif areas (boxed in Fig. 3). The cytochrome b5-related domain contained the eight invariant residues typical for the cytochrome b5 superfamily (marked with asterisks in Fig. 3) and the presence of a heme binding region characterized by the HPGG motif toward the N terminus (32Lederer F. Biochimie (Paris). 1994; 76: 674-692Crossref PubMed Scopus (88) Google Scholar). A heme-containing electron donor is required for fatty acid desaturation, and cytochrome b5 fulfills this function for the membrane-bound desaturase (16Smith M.A. Cross A.R. Jones O.T.G. Griffiths W.T. Stymne S. Stobart A.K. Biochem. J. 1990; 272: 23-29Crossref PubMed Scopus (86) Google Scholar, 33Mitchell A.G. Martin C.E. J. Biol. Chem. 1995; 270: 29766-29772Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (130) Google Scholar, 34Smith M.A. Jonsson L. Stymne S. Stobart A.K. Biochem. J. 1992; 287: 141-144Crossref PubMed Scopus (64) Google Scholar). Therefore, the whole sequence can be considered as coding for a fusion protein consisting of an N-terminal cytochrome b5 and a desaturase. The sequence motif QIEHH of the third histidine box starts with a glutamine instead of a histidine (marked with triangle in Fig. 3), which is the characteristic of the front-end desaturases but is not found in other desaturases such as Δ12- and Δ15-desaturases (35Sayanova O. Beaudoin F. Libisch B. Castel A. Shewry P.R. Napier J.A. J. Exp. Bot. 2001; 52: 1581-1585Crossref PubMed Scopus (61) Google Scholar, 36Sayanova O. Beaudoin F. Libisch B. Shewry P.R. Napier J.A. Biochem. Soc. Trans. 2000; 28: 636-638Crossref PubMed Google Scholar, 37Sperling P. Heinz E. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2001; 103: 158-180Crossref Scopus (59) Google Scholar). Functional Analysis of PPDES5 in Yeast—Fig. 4 shows the results of GC analysis of the fatty acid methyl esters of yeast strains, transformed with the PPDES5 expression construct as described under "Experimental Procedures", to which fatty acid substrates had been supplied. An additional peak is apparent in the trace obtained from induced pYES2-DES5 grown in the presence of di-homo-γ-linolenic acid (DHGLA) (20:3 Δ8,11,14) compared with an empty vector control. The retention time of the additional peak was identical to that of the methyl ester of authentic ARA (20:4 Δ5,8,11,14). This compound also displayed a molecular ion of 318 m/z (the expected molecular ion for methyl ARA) as well as a fragmentation pattern identical to that of the authentic ARA methyl ester. The identity of this compound was further verified by obtaining the diethylamide derivative in order to produce a structure-specific mass spectrum. As shown in Fig. 5, the mass spectrum of the derivatized compound contained a molecular ion of 359 m/z and a fragmentation profile consistent with the ARA diethylamide derivative. Yeast cells transformed with the plasmid pYES2-DES5 had therefore acquired functional specific Δ5-desaturase activity and were now capable of synthesizing ARA (20:4 Δ5,8,11,14) from the substrate DHGLA (20:3 Δ8,11,14). The specific Δ5-desaturase in the transformed yeast appeared to be an efficient catalyst, with 14.7% of the substrate converted to ARA under the conditions of the experiments.FIGURE 5GC mass spectrometry analysis of diethylamide derivative of the novel peak identified in yeast carrying pYES2-DES5 in the presence of DHGLA (20:3 Δ8,11,14). A comparison is shown of the mass spectra of the novel peak (A) and an authentic ARA (20:4 Δ5,8,11,14) standard (B).View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT) To test whether the P. patens Δ5-desaturase was capable of desaturating other substrates, yeast cultures expressing PPDES5 were supplemented with several fatty acids (Table 1). We were unable to detect any novel peaks when C18 and C22 fatty acids were fed to yeast; however, when 20:2 Δ11,14 and 20:3 Δ11,14,17 were provided as substrates, we detected novel peaks with mass spectra consistent with those of methyl 20:3 Δ5,11,14 (13.5%) and 20:4 Δ5,11,14,17 (14.5%), respectively (data not shown). Therefore, P. patens Δ5-desaturase appears to be specific for C20 fatty acids. In addition, we could exclude Δ8-desaturase activity because we could not detect any 20:3 Δ8,11,14 or 20:4 Δ8,11,14,17 from 20:2 Δ11,14 and 20:3 Δ11,14,17 substrates, respectively.TABLE 1Fatty acid substrate specificity of P. patens Δ5-desaturase (PPDES5) Yeast cells transformed with pYES2-DES5 were supplemented with different fatty acids. The FAMEs of total lipids under inducing conditions were analyzed by GC, using flame ionization detection. Conversion was calculated as (product × 100)/(substrate + product) using values corresponding to the peak areas of the corresponding signals. Each value is the mean ± S.D. from three independent experiments.Fatty acid substratesPercentage of substrate converted18:2 (Δ9,12), ω-6 linoleic acid0.0 ± 0.018:3 (Δ9,12,15), ω-3 α-linoleic acid0.0 ± 0.020:2 (Δ11,14), ω-6 eicosadienoic acid13.5 ± 0.320:3 (Δ8,11,14), ω-6 DHGLA14.7 ± 0.520:3 (Δ11,14,17), ω-3 ETA14.5 ± 0.322:4 (Δ7,10,13,16), ω-6 adrenic acid0.0 ± 0.022:5 (Δ7,10,13,16,19), ω-3 docosapentaenoic acid0.0 ± 0.0 Open table in a new tab Fatty Acid Profile in P. patens Wild Type—Several ω-6 and ω-3 fatty acids were detected in wild-type tissue, including saturated, mono-, and polyunsaturated C16-20 fatty acids (Fig. 6). The principle fatty acid detected was ARA (20:4 Δ5,8,11,14), which is the Δ5-desaturation product from DHGLA (20:3 Δ8,11,14) in ω-6 pathway (see Fig. 1). However, from our experiments we could detect very little ω-3 eicosatetraenoic acid (ETA) (20:4 Δ8,11,14,17) despite the presence of its Δ5-desaturation product, EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17). Targeted Gene Replacement—For an alternative proof of the function of PPDES5, we analyzed the total fatty acids of wild type and the three stable transgenic lines (K1-3) having the PPDES5 coding sequence replaced by a selection cassette (Fig. 6). In contrast to the wild type, the transgenic lines lacked the unsaturated fatty acids ARA (20:4 Δ5,8,11,14) and EPA (20:5 Δ5,8,11,14,17), products of the Δ5-desaturation step, and a clear increase in the level of its substrate DHGLA (20:3 Δ8,11,14) and ETA (20:4 Δ8,11,14,17), respectively. Molecular Analysis of the Transgenic Lines—The specific integration of the transformed DNA into the PPDES5 gene was analyzed by PCR using genomic DNA from the three transgenic lines (K1-3) and the wild type. The locations of the different primers are presented in Fig. 2. The 5′-end of primer A and 3′-end of primer D bind 164 bp upstream and 99 bp downstream of the 5′- and 3′-genomic sequences flanking the selection cassette, thus excluding PCR signals resulting from contamination by DNA used for transformation. PCR with primer pair A/B amplified a fr

تحتوي براءات الاختراع Physcomitrella على مستويات عالية من حمض الأراكيدونيك وكميات أقل من حمض إيكوسابنتاينويك. هنا نبلغ عن تحديد وتوصيف مزيل التشبع Δ 5 من P. patens المرتبط بتوليف هذه الأحماض الدهنية. تم تحديد cDNA كامل الطول لهذا الإنزيم منزوع التشبع من خلال عمليات البحث في قاعدة البيانات بناءً على التماثل لتسلسلات cDNAs Δ 5 - desaturase المعروفة من الأنواع الفطرية والطحلبية. تقوم P. patens cDNA الناتجة بتشفير عديد الببتيد المكون من 480 حمض أميني والذي يحتوي على مجال متنبأ به يشبه السيتوكروم B5 بالإضافة إلى ثلاثة مجالات غنية بالهستيدين. أدى التعبير عن الإنزيم في Saccharomyces cerevisiae إلى إنتاج حمض الأراكيدونيك الدهني المحتوي على Δ 5 في الخلايا التي تم تزويدها بحمض ثنائي هومو لينولينيك. بالإضافة إلى ذلك، أنتج الإنزيم المعبر عنه منتجات Δ 5 - disaturation مع ركائز C20 ω -6 eicosadienoic وأحماض ω -3 eicosatrienoic، ولكن لم يتم اكتشاف أي منتجات مع أحماض C18 الدهنية اللينوليك وأحماض α - linolenic أو مع أحماض C22 الدهنية الأدرينالية وأحماض docosapentaenoic. عندما تعطل التسلسل الجيني المناظر لـ P. patens عن طريق الاستبدال من خلال إعادة التركيب المتماثل، لوحظ تغير كبير في تركيبة الأحماض الدهنية، أي زيادة في أحماض داي- هومو- جاما- لينولينيك و eicosatetraenoic مصحوبة باختفاء مصاحب لأحماض Δ 5 - fatty arachidonic و eicosapentaenoic. بالإضافة إلى ذلك، أدى التعبير المفرط عن P. patens cDNA في الخلايا البروتوبلاستية المعزولة من خط معطل إلى استعادة تخليق حمض الأراكيدونيك. تحتوي براءات الاختراع Physcomitrella على مستويات عالية من حمض الأراكيدونيك وكميات أقل من حمض إيكوسابنتاينويك. هنا نبلغ عن تحديد وتوصيف مزيل التشبع Δ 5 من P. patens المرتبط بتوليف هذه الأحماض الدهنية. تم تحديد cDNA كامل الطول لهذا الإنزيم منزوع التشبع من خلال عمليات البحث في قاعدة البيانات بناءً على التماثل لتسلسلات cDNAs Δ 5 - desaturase المعروفة من الأنواع الفطرية والطحلبية. تقوم P. patens cDNA الناتجة بتشفير عديد الببتيد المكون من 480 حمض أميني والذي يحتوي على مجال متنبأ به يشبه السيتوكروم B5 بالإضافة إلى ثلاثة مجالات غنية بالهستيدين. أدى التعبير عن الإنزيم في Saccharomyces cerevisiae إلى إنتاج حمض الأراكيدونيك الدهني المحتوي على Δ 5 في الخلايا التي تم تزويدها بحمض ثنائي هومو لينولينيك. بالإضافة إلى ذلك، أنتج الإنزيم المعبر عنه منتجات Δ 5 - disaturation مع ركائز C20 ω -6 eicosadienoic وأحماض ω -3 eicosatrienoic، ولكن لم يتم اكتشاف أي منتجات مع أحماض C18 الدهنية اللينوليك وأحماض α - linolenic أو مع أحماض C22 الدهنية الأدرينالية وأحماض docosapentaenoic. عندما تعطل التسلسل الجيني المناظر لـ P. patens عن طريق الاستبدال من خلال إعادة التركيب المتماثل، لوحظ تغير كبير في تركيبة الأحماض الدهنية، أي زيادة في أحماض داي- هومو- جاما- لينولينيك و eicosatetraenoic مصحوبة باختفاء مصاحب لأحماض Δ 5 - fatty arachidonic و eicosapentaenoic. بالإضافة إلى ذلك، أدى التعبير المفرط عن P. patens cDNA في الخلايا البروتوبلاستية المعزولة من خط معطل إلى استعادة تخليق حمض الأراكيدونيك. الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة (PUFAs)، 4 الاختصارات المستخدمة هي: PUFA، الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة ؛ ARA، حمض الأراكيدونيك ؛ EPA، حمض إيكوسابنتاينويك ؛ GC، كروماتوغرافيا الغاز ؛ FAME، حمض الميثيل الدهني ؛ DHGLA، حمض دي- هومو- غاما- لينولينيك ؛ ETA، حمض إيكوساترينويك أو حمض إيكوساترينويك .4 الاختصارات المستخدمة هي: PUFA، الأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة ؛ ARA، حمض الأراكيدونيك ؛ EPA، حمض إيكوسابنتاينويك ؛ GC، كروماتوغرافيا الغاز ؛ FAME، حمض الميثيل الدهني ؛ DHGLA، حمض دي- هومو- لينولينيك ؛ ETA، حمض إيكوساترينيك أو حمض إيكوساترينيك. الأحماض الدهنية التي تحتوي على 18 أو أكثر مع ذرات الكربون أو اثنين أو أكثر من الروابط المزدوجة الميثيل- في التمزيج، تلقى الاهتمام في السنوات الأخيرة اهتمامًا متزايدًا لأن لها تأثيرات مفيدة على صحة الإنسان عند تضمينها في النظام الغذائي (LKO. YA. Res. 1999; 40: 211-225 Crossref PubMed Scopus (749) Google Scholar, 2Uauy R. Mena P. Wegher B. Nieto S. Salem Jr.، N. Pediatr. Res. 2000 ؛ 47: 127-135 Crossref PubMed Scopus (194) الباحث العلمي من Google). لا توجد PUFAs طويلة السلسلة (≥ C20) بشكل شائع في كاسيات البذور ؛ ومع ذلك، فهي موجودة في بعض العاريات (3Wolff rl Pedrono F. Pasquier E. Marpeau A.M. Lipids. 2000 ؛ 35: 1-22 Crossref PubMed Scopus (80) الباحث العلمي من Google). تم العثور على نسب عالية من تراكم PUFA في العديد من الطحالب والطحالب والسراخس (4Ackman RG Tocher C.S. McLachlan JJ Fish Res. Bd. Can. 1968; 25: 1603-1620 Crossref Google Scholar, 5Dembitsky V.M. Prog. Lipid. Res. 1993; 32: 281-356 Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar, 6Jamieson G.R. Reid E.H. Phytochemistry. 1975 ؛ 14: 2229-2232 Crossref Scopus (26) الباحث العلمي من Google). لا تزال وظيفة هذه PUFAs طويلة السلسلة في أغشية النباتات السفلية غير واضحة، في حين أنها تلعب دورًا في استقلاب الإيكوزانويد في البشر (7Samuelsson B. Science. 1983 ؛ 220: 568-575 Crossref PubMed Scopus (2307) الباحث العلمي من Google). الطحلب Physcomitrella patens (Hedw.) B. S. G. (Funariales، Bryophyta) يحتوي على نسب عالية من حمض الأراكيدونيك (ARA) (20:4 Δ 5،8،11،14) وبعض حمض eicosapentaenoic (EPA) (20:5 Δ 5،8،11،14،17) (8Grimsley NH Grimsley J.M. Hartmann E. Phytochemistry. 1981 ؛ 20: 1519-1524 كروسريف سكوبس (24) الباحث العلمي من جوجل). في الثدييات، ARA (20:4 Δ 5،8،11،14) و EPA (20:5 Δ 5،8،11،14،17) هي سلائف للجزيئات التنظيمية قصيرة العمر، و eicosanoids، التي تتألف من البروستاجلاندين، و leukotrienes، و thromboxanes (9Horrobin D.F. Prog. Lipid. Res. 1992; 31: 163-194 Crossref PubMed Scopus (414) Google Scholar, 10Sayanova O.V. Napier J.A. Phytochemistry. 2004 ؛ 65: 147-158 Crossref PubMed Scopus (136) Google Scholar, 11Roynette C.E. Calder P.C. Dupertuis Y.M. Pichard C. Clin. نوتر. 2004 ؛ 23: 139-151 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (219) الباحث العلمي من Google). تعمل هذه المركبات محليًا من خلال عملية أوتوكرين أو باراكرين على مستقبلات سطح الخلية المرتبطة بالبروتين G. وهذا يؤدي إلى تنشيط آليات الإشارات المختلفة التي لها تأثيرات على العديد من الوظائف الخلوية بما في ذلك الانجذاب الكيميائي، ونفاذية الأوعية الدموية، والالتهاب، وتضيق الأوعية، وتنظيم الجهاز المناعي، وتخثر الدم، والنقل العصبي، واستقلاب الكوليسترول (12Jump D.B.J. Biol. Chem. 2002; 277: 8755-8758 Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (497) Google Scholar, 13Funk C.D. Science. 2001 ؛ 294: 1871-1875 Crossref PubMed Scopus (2966) Google Scholar، 14Horrobin D.F. Rev. Contemp. صيدلية. 1990 ؛ 1: 1-45 الباحث العلمي من Google). يتم تحويل ARA (20:4 Δ 5،8،11،14) و EPA (20:5 Δ 5،8،11،14،17) من حمض اللينوليك (18:2 Δ 9،12) وحمض ألفا لينولينيك (18:3 Δ 9،12،15)، على التوالي، من خلال أنشطة Δ 6 - desaturase و Δ 6 - elongase و Δ 5 - desaturase. تم تعيين سلسلة التفاعل هذه كمسار ω -6 لتوليف ARA (20:4 Δ 5،8،11،14) ومسار ω -3 لتوليف EPA (20:5 Δ 5،8،11،14،17) (انظر الشكل. 1). يُعتقد أن مزيلات التشبع تعمل مثل مزيلات التشبع الميكروسومية الأخرى من النباتات والخميرة الأعلى، مما يحفز التفاعلات الهوائية التي تتطلب السيتوكروم b5 كعامل مساعد. يتم نقل الإلكترونات من اختزال السيتوكروم b5 المعتمد على NADH عبر جزيء السيتوكروم b5 المحتوي على الهيم إلى مزيل تشبع الأحماض الدهنية (15Dailey H.A. Strittmatter P. J. Biol. Chem. 1980; 255: 5184-5189 Abstract Full Text PDF PubMed Google Scholar, 16Smith M.A. Cross A.R. Jones O.T.G. Griffiths W.T. Stymne S. Stobart A.K. Biochem. J. 1990; 272: 23-29 Crossref PubMed Scopus (86) Google Scholar, 17Pereira S.L. Leonard A.E. Mukerji P. Prostaglandins Leukotrienes Essent. الأحماض الدهنية. 2003 ؛ 68: 97-106 ملخص النص الكامل PDF PubMed Scopus (181) Google Scholar، 18Wallis J.G. Watt J.L. Browse J. Trends Biochem. الخيال العلمي. 2002 ؛ 27: 467-473 ملخص النص الكامل النص الكامل PDF PubMed Scopus (264) الباحث العلمي من Google). ومع ذلك، كان التوصيف الكيميائي الحيوي لنزعات التشبع المرتبطة بالغشاء محدودًا لأنه يصعب تنقيتها بسبب ارتباطها بالغشاء. كشف تحليل تسلسلات البروتين المتوقعة لإنزالات التشبع النباتية الأعلى جنبًا إلى جنب مع تلك الموجودة في البكتيريا الزرقاء والخميرة والثدييات عن وجود ثمانية بقايا هيستيدين محفوظة للغاية (19Shanklin J. Whittle E. Fox D.C. الكيمياء الحيوية. 1994 ؛ 33: 12787-12794 Crossref PubMed Scopus (638) الباحث العلمي من Google). لأن الطحالب P. patens يمكن أن تنتج نسبًا عالية من ARA (20:4 Δ 5،8،11،14) وبعض EPA (20:5 Δ 5،8،11،14،17) (8Grimsley NH Grimsley J.M. Hartmann E. Phytochemistry. 1981 ؛ 20: 1519-1524 Crossref Scopus (24) Google Scholar)، يمكن أن يكون بمثابة نموذج لدراسة الآلية الكامنة وراء التخليق الحيوي لـ PUFAs. تم حتى الآن استنساخ الجينات التي تشفر Δ 6 - desaturase و Δ 6 - elongase فقط من هذا الكائن الحي (20Girke T. Schmidt H. Zahringer U. Reski R. Heinz E. Plant J. 1998 ؛ 15: 39-48 Crossref PubMed Scopus (169) Google Scholar، 21Zank T.K. Zahringer U. Beckmann C. Pohnert G. Boland W. Holtorf H. Reski R. Lerchl J. Heinz E. Plant J. 2002 ؛ 31: 255-268 Crossref PubMed Scopus (90) Google Scholar). ومع ذلك، فإن جينات P. patens التي تشفر Δ 5 - desaturase التي تحفز الخطوة التالية في التخليق الحيوي لـ PUFAs لم يتم تحديدها وظيفيًا بعد. يمكن أن ينتشر هذا الطحلب نباتيًا في حالة أحادية الصيغة الصبغية (22Ashton N.W. Cove D.J. Mol. Gen. Genet. 1977; 154: 87-95 Crossref Scopus (329) Google Scholar, 23Cove D.J. Annu. Rev. Genet. 2005; 39: 339-358 Crossref PubMed Scopus (164) Google Scholar)، الذي يبسط التحليل الظاهري بعد الطفرة أو التحول (24Schaefer D. Zryd J.P. Knight C.D. Cove D.J. Mol. Gen. Genet. 1991; 226: 418-424 Crossref PubMed Scopus (186) Google Scholar). يمكن تعطيل الجينات على وجه التحديد عن طريق استبدال الجينات المستهدف، والذي يحدث بتردد عالٍ في P. patens (23Cove D.J. Annu. Rev. Genet. 2005; 39: 339-358 Crossref PubMed Scopus (164) Google Scholar, 25Kamisugi Y. Cuming A.C. Cove D.J. Nucleic Acids Res. 2005; 33: e173 Crossref PubMed Scopus (59) Google Scholar). في الدراسة الحالية، تم تحديد Δ 5 - desaturase المرتبط بالتخليق الحيوي لـ ARA (20:4 Δ 5,8,11,14) و EPA (20:5 Δ 5,8,11,14,17) في P. patens وظيفيًا عن طريق التعبير غير المتجانس في Saccharomyces cerevisiae، عن طريق الاضطراب المستهدف للجين المقابل، وعن طريق التعبير العابر في الخط الجيني المعطل. تم الحصول على إنزيمات تقييد المواد والبوليميرازات والإنزيمات المعدلة للحمض النووي من مختبرات نيو إنجلاند الحيوية ما لم تتم الإشارة إلى خلاف ذلك. كانت جميع المواد الكيميائية الأخرى المستخدمة من درجة الكاشف من سيجما. تم شراء الأحماض الدهنية من Nu - Check - Prep (Elysian، MN). المواد النباتية وظروف النمو - سلالة جرانسدن من P. patens (22Ashton NW Cove D.J. Mol. تم استخدام Gen. Genet. 1977 ؛ 154: 87-95 Crossref Scopus (329) Google Scholar) طوال فترة الدراسات. تم زراعة البروتونات البالغة من العمر 7 أيام على وسط BCD صلب تمت إضافة طرطرات ثنائي الأمونيوم إليه إلى 5 مم وزراعتها عند 25 درجة مئوية تحت ضوء مستمر توفره أنابيب الفلورسنت (26Knight C.D. Cove D.J. Cuming A.C. Quatrano R.S. Gilmartin PM Bowter C. Molecular Plant Biology. 2. مطبعة جامعة أكسفورد، أكسفورد، نيويورك 2002: 285-301 الباحث العلمي من Google). عزل الحمض النووي الريبوزي والتلاعب به - تم عزل الحمض النووي الريبوزي الكلي من 50 ملغ من الوزن الطازج للأنسجة البروتونية باستخدام مجموعة RNeasy Plant المصغرة (Qiagen)، وتم نسخ 5 ميكروغرام باستخدام نظام PCR للنسخ العكسي Thermo - Script™ (Invitrogen) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم استخدام cDNA كقالب لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل مع البرايمر. عزل الحمض النووي الجيني - تم طحن ما يقرب من 1 غرام من الوزن الطازج للأنسجة البروتونية إلى مسحوق ناعم تحت النيتروجين السائل باستخدام ملاط ومدقة مبردة مسبقًا. تم استخراج الحمض النووي الجيني من الأنسجة الأرضية باستخدام مجموعة استخراج الحمض النووي الجيني Nucleon™ PhytoPure™ (Amersham Biosciences) وفقًا لتعليمات الشركة المصنعة. تم استرداد الحمض النووي عن طريق ترسيب الإيثانول وتم إذابته في عازل TE (10 مم Tris - HCl، الرقم الهيدروجيني 7.5، 1 مم EDTA). تم تصنيع أجهزة الاستنساخ القائمة على تفاعل البوليميراز المتسلسل PCR بناءً على بيانات تسلسل NCBI (27Zank T. Bauer J. Cirpus P. Abadi A. Heinz E. Qiu X. Vrinten P. Sperling P. Domergue F. Meyer A. Kirsch J. PCT. 2005 عالم جوجل). كان التمهيدي الأمامي هو PPFOR1، 5′ - ATGGCGCCACTCTG -3 ′، وكان التمهيدي العكسي هو PPREV1، 5′ -TCAGCCATCGAGCCGAAACT-3′. تم تنفيذ تفاعل البوليميراز المتسلسل في حجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر. 10 ميكرومتر تم استخدام كل من البادئات لتضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل للحمض النووي الدنوي المقلوب من إجمالي الحمض النووي الريبي. بعد التمدد الأولي عند 94 درجة مئوية لمدة 4 دقائق، تم إجراء التضخيم في 35 دورة من 1 دقيقة عند 94 درجة مئوية، 0.5 دقيقة عند 54 درجة مئوية، و 2.5 دقيقة عند 72 درجة مئوية، تليها تمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق أخرى. تم تجزئة منتجات التضخيم على 1.0 ٪ من هلام الأغاروز وربطها مباشرة بـ pCR ® 2.1-TOPO ® (Invitrogen) وتم تحويل البلازميدات المستخدمة إلى خلايا الإشريكية القولونية المؤهلة كيميائياً (Invitrogen). تمت تنقية الحمض النووي البلازميدي وتسلسله في كلا الاتجاهين باستخدام ABI BigDye v3.1 وجهاز تسلسل آلي، مما أدى إلى إنتاج البلازميد PPDES5. التحليل الوظيفي: تحويل الخميرة - تم استنساخ إطار القراءة المفتوح لـ PPDES5 cDNA بجوار معزز GAL1 المستحث بالجالاكتوز لمتجه تعبير الخميرة pYES2 (Invitrogen). لهذا الغرض، تم استخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل مع برايمر PPFOR1 و PPREV1 الذي يضيف مواقع تقييد HindIII و XhoI في طرفي 5'- و 3'، على التوالي، لتضخيم PPDES5 البلازميد. تم ربط منتج تفاعل البوليميراز المتسلسل المضخم إلى تفاعل البوليميراز المتسلسل ® 2.1 - TOPO ® (إنفيتروجين) وتم تحويل البلازميدات المستخدمة إلى خلايا الإشريكية القولونية المؤهلة كيميائياً (إنفيتروجين) مرة أخرى. تم هضم إطار القراءة المفتوح الكامل للإنزيم منزوع التشبع مع HindIII/XhoI وربطه بمواقع HindIII/XhoI لمتجه pYES2 (Invitrogen) لإنتاج pYES2 - DES5 البلازميد. تم التحقق من تسلسله من خلال تسلسل الحمض النووي. تم تحويل البلازميدات pYES2 - DES5 و pYES2 إلى S. cerevisiae YPH499 (ATCC، Manassas، VA) بواسطة مجموعة تحويل S.c. Easy - Comp™ (Invitrogen). بعد اختيار اليوراسيل على الحد الأدنى من صفائح الآجار المتوسطة، تم زراعة الخلايا التي تحتوي على بلازميدات الخميرة في خليط كامل من اليوراسيل المتسرب (CSM - URA) (Krackeler Scientific) يحتوي على 1.0 ٪ (وزن/حجم) من الرافينوز كمصدر حصري للكربون و 0.4 ٪ Tergitol Nonidet P -40 (Sigma) لإذابة الأحماض الدهنية. بالنسبة لتجارب التعبير الجيني، نمت المزارع إلى كثافة بصرية (600 نانومتر) تبلغ 0.3 في وسط CSM - URA (Krackeler Scientific). تم حث التعبير عن منطقة ترميز PPDES5 بإضافة الجالاكتوز إلى 2.0 ٪ (وزن/حجم). تمت إضافة الأحماض الدهنية إلى 0.7 مم ونمت المزارع لمدة 24 ساعة عند 28 درجة مئوية. اضطراب الجينات المستهدف لـ PPDES5 في P. patens - بسبب اضطراب PPDES5 بسبب استهداف الجينات، تم استبدال تسلسل الترميز للنسخة الجينية من PPDES5 بمنهي 35S - hph - nos، كاسيت مقاوم للهيغروميسين (23Cove D.J. Annu. Rev. Genet. 2005; 39: 339-358 Crossref PubMed Scopus (164) Google Scholar)، بحيث كان شريط التحديد محاطًا بـ 1536 و 1234 زوجًا من أزواج القواعد (bp) الجينومية المتماثلة مع 5'- و 3'-أذرع PPDES5، على التوالي (انظر الشكل. 2). تم تصنيع زوجين تمهيديين محددين (التمهيدي 1، 5′ - TAGGGCCACCCTTTGCTTCG -3 ′، التمهيدي 2، 5′ - ATGGGCCCCCAGTTCGTCCCAG -3 ′؛ التمهيدي 3، 5′ - ATGGACCAGGCAAGTAATAAGTGA -3 ′، والبرايمر 4، 5 ′ - ATATGCATGAACGAAAGTAGTAGTCCTGTC -3 ′) بناءً على تسلسل جينوم P. patens المقابل من قاعدة بيانات معهد الجينوم المشترك التابع لوزارة الطاقة الأمريكية (انظر الشكل 2). بعد تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام هذه المواد التمهيدية من قالب الحمض النووي الجيني من النوع البري، تم استنساخ شظايا تفاعل البوليميراز المتسلسل ذات الطول المتوقع (1536 و 1234 نقطة أساس) بشكل منفصل في متجه PGEM ®- TEASY (Promega)، الذي تم إطلاقه عن طريق الهضم باستخدام ApaI و SalI/NsiI، على التوالي ثم ربطه في متجه rr1 يحتوي على كاسيت مقاوم للهيجروميسين. في وقت لاحق، تم هضم بنية الاضطراب مع XhoI/HindIII، مما أدى إلى جزء خطي مع الكاسيت في مركزه محاطًا بتسلسلات جينومية تبلغ 1252 و 554 نقطة أساس. تم ترسيب هذا الحمض النووي الخطي واستخدامه للتحول دون فصله عن المتجه. تم إجراء نقل مباشر للحمض النووي بوساطة البولي إيثيلين إلى الخلايا البروتوبلاستية كما وصفه شايفر وآخرون. (24Schaefer D. Zryd J.P. Knight C.D. Cove D.J. Mol. Gen. Genet. 1991; 226: 418-424 Crossref PubMed Scopus (186) Google Scholar) مع التعديلات. تم تجديد البروتونات لمدة 7 أيام على وسط صلب يحتوي على الهيغرومايسين (25 ميكروغرام/مل)، ونقلها إلى وسط بدون مضاد حيوي لمدة 7 أيام، وإعادة نقلها إلى وسط انتقائي لمدة 7 أيام أخرى. تم تعريف النباتات التي تنمو بقوة والتي نجت من نظام الاختيار هذا على أنها محولات مستقرة. تم تحليل أحداث استهداف التحليل الجزيئي بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل والنظافة الجنوبية. لهذا الغرض، تم استخراج الحمض النووي الجيني للنباتات البرية والنباتات المعدلة وراثيًا وتم تأكيد حدث التكامل 5'من خلال تجارب تفاعل البوليميراز المتسلسل مع التمهيدي A (5′- GACCTACCGAACTTCGA -3 ′) المقابل للتسلسل الجيني لبراءات الاختراع ولكن 164 bp في المنبع من نهاية 5′ من ناقل الاستبدال والبرايمر B (5 ′- ACCATCTGTGTTAGCGTCC -3 ′) المستمدة من منطقة معزز 35S لشريط الاختيار. تم تأكيد حدث التكامل 3′ أيضًا بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل مع التمهيدي C (5′- ATGAAAAAGCCTGAACTACCG -3 ′) المشتق من النهاية 5′ لمنطقة ترميز hph والتمهيدي D (5′- GACTCAACTGTAGTAGC -3 ′) المقابل للتسلسل الجيني لـ P. patens ولكن 99 bp في اتجاه مجرى 3′-end لشريط الاختيار (انظر الشكل 2 لمعرفة موقع التمهيدي). تم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل بحجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر. احتوى كل تفاعل على 0.2 ميكرومتر لكل من المواد الأولية، و 200 ميكرومتر لكل من dNTPs، و PCR buffer، و 2 مل من مزيج إنزيم Elongase ® (Invitrogen). كانت ظروف التدوير الحراري على النحو التالي: تمدد أولي لمدة 4 دقائق عند 94 درجة مئوية، تليها 35 دورة لمدة دقيقة واحدة عند 94 درجة مئوية، و 0.5 دقيقة عند 50 درجة مئوية، و 5 دقائق عند 72 درجة مئوية، وتنتهي بتمديد نهائي لمدة 10 دقائق عند 72 درجة مئوية. لتحليل البقعة الجنوبية، تم هضم 1 ميكروغرام من سوائل الحمض النووي الجيني من النوع البري والنباتات المعدلة وراثيًا مع إنزيمات التقييد المناسبة وفصلها على الرحلان الكهربائي لهلام الأغاروز بنسبة 0.6 ٪. تم تنفيذ خطوات الغسيل النهائية في 0.1× SSC مع 0.1 ٪ SDS عند 65 درجة مئوية. تم الكشف باستخدام ركيزة كيميائية مضيئة (CSPD ؛ Roche Applied Science). التعبير الجيني العابر لـ PPDES5 - تم استخدام المواد التمهيدية مع PPFOR2، 5 ′- CACCATGGCGCCACTCTG -3 ′، و PPREV2، 5 ′- TCAAGACCAGCCTCGCATCTTCCAAGAGCCACTCGAGAAACT -3 ′، لتضخيم PCR لـ pYES2 - DES5 مع KlentaqLA. 5 حاصل على براءة اختراع من دبليو بارنز. تم إجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل بحجم إجمالي قدره 50 ميكرولتر. يحتوي كل تفاعل على 0.4 ميكرومتر لكل من المواد التمهيدية، و 100 ميكرومتر لكل من dNTPs، و PCR buffer، و 1.5 مم MgCl2، و 0.5 ميكرولوف KlentaqLA.5 كانت ظروف التدوير الحراري على النحو التالي: تغيير أولي لمدة 4 دقائق عند 94 درجة مئوية تليها 28 دورة من 1 دقيقة عند 94 درجة مئوية، و 0.5 دقيقة عند 54 درجة مئوية، و 2.5 دقيقة عند 72 درجة مئوية، ويتم إنهاؤها بتمديد نهائي لمدة 10 دقائق عند 72 درجة مئوية. تم دمج منتجات التضخيم مباشرة في ناقلات pENTR™/D - TOPO ® (Invitrogen). يحتوي بلازميد إعادة التركيب الناتج على تسلسل PPDES5 محاطًا بتسلسلات إعادة التركيب attL. ثم أعيد دمجه مع مواقع ATR باستخدام مزيج إنزيم Gateway® LR Clonase™ II (Invitrogen). نقل هذا التفاعل تسلسل PPDES5 إلى متجه الوجهة المطلوب (tk1). تم تحويل ناقل الوجهة الذي يحتوي على جين، PPDES5، مدفوعًا بمعزز 35S، إلى بروتوبلاستات من السلالة المستهدفة (24Schaefer D. Zryd J.P. Knight C.D. Cove D.J. Mol. Gen. Genet. 1991; 226: 418-424 Crossref PubMed Scopus (186) Google Scholar). تمت زراعة البروتوبلاستات المتجددة في وسط BCD سائل مكمل بطرطرات دي أمونيوم 5 مم و 6 ٪ مانيتول لمدة يومين قبل تحليل الأحماض الدهنية. تحليل الأحماض الدهنية - تم تحليل إجمالي الأحماض الدهنية المستخرجة من مزارع الخميرة والطحالب عن طريق كروماتوغرافيا الغاز (GC) لإسترات الميثيل. تمت معالجة الدهون من أنسجة الخميرة والطحالب باستخدام ميثوكسيد الصوديوم بنسبة 1 ٪ في الميثانول وحمض الكبريتيك بنسبة 2.5 ٪ في الميثانول، على التوالي، عند 85 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم تم استخراج إسترات ميثيل الأحماض الدهنية (FAMEs) في الهبتان. تم إجراء تحليل GC لـ FAMEs باستخدام كروماتوغراف الغاز من سلسلة Agilent 6890N المزود بعمود شعري HP - INNOWax 0.25 مم × 30 م × 0.25 مم وكاشف تأين اللهب. تم تحديد الأحماض الدهنية بالمقارنة مع أوقات الاحتفاظ بالمعايير. تم تقدير النسب المئوية النسبية للأحماض الدهنية من مناطق الذروة. كما تم تمييز الأحماض الدهنية المقابلة على مشتق ثنائي إيثيل أميد عن طريق قياس الطيف الكروماتوغرافي للغاز باستخدام سلسلة Agilent 6890N التي تعمل عند جهد تأين قدره 70 إلكترون فولت مع نطاق مسح يتراوح بين 50-500 دا. استنساخ براءات الاختراع ذات الغشاء المرتبط بغشاء نزع التشبع - حظيت براءات الاختراع ذات الطحالب باهتمام بسبب قدرتها على إنتاج العديد من PUFAs، بما في ذلك ARA (20:4 Δ 5،8،11،14) و EPA (20:5 Δ 5،8،11،14،17) (8Grimsley NH Grimsley J.M. Hartmann E. Phytochemistry. 1981 ؛ 20: 1519-1524 كروسريف سكوبس (24) الباحث العلمي من جوجل). لذلك كنا مهتمين بالمعلومات الجزيئية الكامنة وراء التخليق الحيوي لهذه الأحماض الدهنية. لتحديد الترميز الجيني لمزيل التشبع المتضمن في الخطوة النهائية لـ ARA (20:4 Δ 5،8،11،14) و EPA (20:5 Δ 5،8،11،14،17)، تم إجراء عمليات بحث قاعدة بيانات NCBI في براءات الاختراع واستخدم التسلسل المحدد بناءً على هويته المحدودة مع مزيلات التشبع الأخرى Δ 5 (27Zank T. Bauer J. Cirpus P. Abadi A. Heinz E. Qiu X. Vrinten P. Sperling P. Domergue F. Meyer A. Kirsch J. PCT. 2005 الباحث العلمي من Google). تم تضخيم cDNA من mRNA المنسوخ عكسيًا من أنسجة بروتونيمية عمرها 7 أيام من P. patens بواسطة PCR. تم استنساخ منتج تضخيم يحتوي على الطول المتوقع وتسلسله. يبلغ إطار القراءة المفتوح لـ PPDES5 cDNA 1443 نقطة أساس من بداية ATG إلى كود إيقاف TGA ورموز لـ 480 حمضًا أمينيًا بكتلة جزيئية تبلغ 54.3 كيلو دالتون. أشارت عمليات البحث في بنك البيانات والمحاذاة مع هذا التسلسل إلى التشابه مع مزيلات تشبع شحوم الأسيل من البقايا 190-454، مع مجال يشبه السيتوكروم b5 في الطرف N من البقايا 36-107. كشفت مقارنة تسلسل الأحماض الأمينية باستخدام برنامج ClustalW أن PPDES5 لديه أقوى تشابه مع Δ 5 - desaturase من عشب الكبد Marchantia polymorpha (هوية 66 ٪) (28Kajikawa M. Yamato KT Kohzu Y. Nojiri M. Sakuradani E. Shimizu S. Sakai Y. Fukuzawa H. Ohyama K. Plant Mol. Biol. 2004 ؛ 54: 335-352 Crossref PubMed Scopus (51) الباحث العلمي من Google) ويشترك أيضًا في هوية 36 ٪ مع Δ 5 - desaturase من Dictyostelium discoideum (29 Saito T. Morio T. Ochiai H. Eur. J. Biochem. 2000 ؛ 267: 1813-1818 Crossref PubMed Scopus (22) Google Scholar، 30Saito T. Ochiai H. Eur. J. Biochem. 1999; 265: 809-814 Crossref PubMed Scopus (17) Google Scholar) و Mortierella alpina (31Michaelson L.V. Lazarus C.M. Griffiths G. Napier J.A. Stobart A.K. J. Biol. Chem. 1998; 273: 19055-19059 Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (142) Google Scholar)، وهو مطلوب لإزالة إشباع PUFAs. تشير المحاذاة مع تلك التسلسلات إلى أن التماثل يحدث بشكل أساسي في المجال الشبيه بالسيتوكروم b5 والذي يعمل كمتبرع بالإلكترون (محاصر بخطوط مكسورة في الشكل 3) وفي مناطق الزخارف الثلاثة الغنية بالهستيدين المحفوظة (محاصر في الشكل 3). احتوى المجال المرتبط بالسيتوكروم b5 على المخلفات الثمانية الثابتة النموذجية لعائلة السيتوكروم b5 الفائقة (المميزة بعلامات نجمية في الشكل 3) ووجود منطقة ربط هيم تتميز بزخارف HPGG تجاه الطرف N (32Lederer F. Biochimie (باريس). 1994 ؛ 76: 674-692 Crossref PubMed Scopus (88) الباحث العلمي من Google). مطلوب مانح إلكترون يحتوي على الهيم لإزالة تشبع الأحماض الدهنية، ويفي السيتوكروم b5 بهذه الوظيفة لإزالة التشبع المرتبط بالغشاء (16Smith M.A. Cross A.R. Jones O.T.G. Griffiths W.T. Stymne S. Stobart A.K. Biochem. J. 1990; 272: 23-29 Crossref PubMed Scopus (86) Google Scholar, 33Mitchell A.G. Martin C.E. J. Biol. Chem. 1995; 270: 29766-29772Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (130) Google Scholar, 34Smith M.A. Jonsson L. Stymne S. Stobart A.K. Biochem. J. 1992 ؛ 287: 141-144 Crossref PubMed Scopus (64) الباحث العلمي من Google). لذلك، يمكن اعتبار التسلسل بأكمله ترميزًا لبروتين اندماجي يتكون من السيتوكروم b5 الطرفي N ومزيل التشبع. يبدأ عزر التسلسل QIEHH لصندوق الهيستيدين الثالث بالجلوتامين بدلاً من الهيستيدين (المميز بالمثلث في الشكل 3)، وهو سمة من سمات مزيلات التشبع الأمامية ولكن لم يتم العثور عليه في مزيلات التشبع الأخرى مثل Δ 12 - و Δ 15 - مزيلات التشبع (35Sayanova O. Beaudoin F. Libisch B. Castel A. Shewry P.R. Napier J.A. J. Exp. BOT. 2001; 52: 1581-1585 Crossref PubMed Scopus (61) Google Scholar, 36Sayanova O. Beaudoin F. Libisch B. Shewry P.R. Napier J.A. Biochem. Soc. Trans. 2000; 28: 636-638 Crossref PubMed Google Scholar, 37Sperling P. Heinz E. Eur. J. Lipid Sci. Technol. 2001 ؛ 103: 158-180 Crossref Scopus (59) الباحث العلمي من Google). يُظهر التحليل الوظيفي لـ PPDES5 في شكل الخميرة. 4 نتائج تحليل GC لإسترات ميثيل الأحماض الدهنية لسلالات الخميرة، والتي تم تحويلها باستخدام بنية تعبير PPDES5 كما هو موضح تحت عنوان "الإجراءات التجريبية"، والتي تم توفير ركائز الأحماض الدهنية لها. تظهر ذروة إضافية في التتبع الذي تم الحصول عليه من pYES2 - DES5 المستحثة المزروعة في وجود حمض ثنائي هومو جاما لينولينيك (DHGLA) (20:3 Δ 8،11،14) مقارنة بمكافحة ناقلات الأمراض الفارغة. كان وقت الاحتفاظ بالذروة الإضافية مطابقًا لوقت استير الميثيل لـ ARA الأصلي (20:4 Δ 5،8،11،14). عرض هذا المركب أيضًا أيونًا جزيئيًا قدره 318 م/ز (أيون جزيئي متوقع لميثيل آرا) بالإضافة إلى نمط تجزئة مطابق لنمط إستر ميثيل آرا الأصلي. تم التحقق من هوية هذا المركب بشكل أكبر من خلال الحصول على مشتق ثنائي إيثيل أميد من أجل إنتاج طيف كتلي خاص بالبنية. كما هو موضح في الشكل 5، احتوى الطيف الكتلي للمركب المشتق على أيون جزيئي قدره 359 م/ز وشكل تجزئة يتوافق مع مشتق آرا ثنائي إيثيل أميد. وبالتالي، اكتسبت خلايا الخميرة التي تحولت مع البلازميد pYES2 - DES5 نشاطًا نوعيًا وظيفيًا Δ 5 - desaturase وكانت الآن قادرة على تخليق ARA (20:4 Δ 5،8،11،14) من الركيزة DHGLA (20:3 Δ 8،11،14). يبدو أن Δ 5 - desaturase المحدد في الخميرة المحولة محفز فعال، حيث تم تحويل 14.7 ٪ من الركيزة إلى ARA في ظل ظروف التجارب. الشكل 5GC تحليل الطيف الكتلي لمشتق ثنائي إيثيل أميد للذروة الجديدة المحددة في الخميرة التي تحمل pYES2 - DES5 في وجود DHGLA (20:3 Δ 8،11،14). يتم عرض مقارنة بين الأطياف الكتلية للذروة الجديدة (A) ومعيار ARA الأصلي (20:4 Δ 5،8،11،14) (B). عرض عارض شكل الصورة الكبيرتحميل تنزيل صورة عالية الدقة (PPT) لاختبار ما إذا كانت P. patens Δ 5 - desaturase قادرة على إزالة التشبع من الركائز الأخرى، تم استكمال مزارع الخميرة التي تعبر عن PPDES5 بالعديد من الأحماض الدهنية (الجدول 1). لم نتمكن من اكتشاف أي قمم جديدة عندما تم تغذية الأحماض الدهنية C18 و C22 إلى الخميرة ؛ ومع ذلك، عندما تم توفير 20:2 Δ 11،14 و 20:3 Δ 11،14،17 كركائز، اكتشفنا قمم جديدة مع أطياف كتلية تتفق مع تلك الخاصة بالميثيل 20:3 Δ 5،11،14 (13.5 ٪) و 20:4 Δ 5،11،14،17 (14.5 ٪)، على التوالي (البيانات غير موضحة). لذلك، يبدو أن P. patens Δ 5 - desaturase خاص بالأحماض الدهنية C20. بالإضافة إلى ذلك، يمكننا استبعاد نشاط Δ 8 - desaturase لأننا لم نتمكن من اكتشاف أي 20:3 Δ 8،11،14 أو 20:4 Δ 8،11،14،17 من 20:2 Δ 11،14 و 20:3 Δ 11،14،17 ركائز، على التوالي. تم استكمال خصائص ركيزة الحمض الدهني لـ P. patens Δ 5 - desaturase (PPDES5) خلايا الخميرة المحولة مع pYES2 - DES5 بأحماض دهنية مختلفة. تم تحليل FAMEs من إجمالي الدهون تحت ظروف الحث من قبل GC، باستخدام الكشف عن تأين اللهب. تم حساب التحويل على أنه (المنتج × 100)/(الركيزة + المنتج) باستخدام القيم المقابلة لمناطق الذروة للإشارات المقابلة. كل قيمة هي المتوسط ± S.D. من ثلاث تجارب مستقلة. ركائز الأحماض الدهنية 18:2 (Δ 9،12)، ω -6 حمض اللينوليك 0.018:3 (Δ 9،12،15)، ω -3 حمض ألفا لينوليك 0.020:2 (Δ 11،14)، ω -6 حمض الإيكوسادينويك 13.5 ± 0.320:3 (Δ 8،11،14)، ω -6 DHGLA14.7 ± 0.520:3 (Δ 11،14،17)، ω -3 ETA14.5 ± 0.322:4 (Δ 7،10،13،16)، ω -6 حمض الأدرينيك 0.022:5 (Δ 7،10،13،16،19)، ω -3 حمض docosapentaenoic 0.0 ± 0.0 جدول مفتوح في ملف تعريف حمض دهني جديد في P. Patens Type - Everal ω -6 و ω -3 تم اكتشاف الأحماض الدهنية في الأنسجة البرية، بما في ذلك الأنسجة المشبعة، أحادية، أحماض C16 -20 (أحماض الدهنية متعددة الأحماض). 6). كان الحمض الدهني الرئيسي المكتشف هو ARA (20:4 Δ 5،8،11،14)، وهو منتج عدم التشبع Δ 5 من DHGLA (20:3 Δ 8،11،14) في مسار ω -6 (انظر الشكل. 1). ومع ذلك، من خلال تجاربنا، استطعنا اكتشاف القليل جدًا من حمض ω -3 eicosatetraenoic (ETA) (20:4 Δ 8،11،14،17) على الرغم من وجود منتج إزالة التشبع Δ 5، EPA (20:5 Δ 5،8،11،14،17). استبدال الجينات المستهدفة - للحصول على دليل بديل على وظيفة PPDES5، قمنا بتحليل إجمالي الأحماض الدهنية من النوع البري والخطوط الثلاثة المعدلة وراثيًا المستقرة (K1 -3) التي تم استبدال تسلسل ترميز PPDES5 بشريط اختيار (الشكل. 6). على النقيض من النوع البري، افتقرت الخطوط المعدلة وراثيًا إلى الأحماض الدهنية غير المشبعة ARA (20:4 Δ 5،8،11،14) و EPA (20:5 Δ 5،8،11،14،17)، ومنتجات خطوة تشويه Δ 5، وزيادة واضحة في مستوى ركيزتها DHGLA (20:3 Δ 8،11،14) و ETA (20:4 Δ 8،11،14،17)، على التوالي. التحليل الجزيئي للخطوط المعدلة وراثيًا - تم تحليل التكامل المحدد للحمض النووي المحول إلى جين PPDES5 بواسطة تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الحمض النووي الجيني من الخطوط المعدلة وراثيًا الثلاثة (K1 -3) والنوع البري. يتم عرض مواقع المواد التمهيدية المختلفة في الشكل 2. تربط النهاية 5بوصة من التمهيدي A و 3بوصة من التمهيدي D 164 نقطة أساس في المنبع و 99 نقطة أساس في المنبع للتسلسلات الجينية 5بوصة و 3بوصة التي تحيط بشريط الاختيار، وبالتالي تستبعد إشارات تفاعل البوليميراز المتسلسل الناتجة عن التلوث بالحمض النووي المستخدم في التحويل. تم تضخيم PCR مع الزوج التمهيدي A/B