La conversion de l'énergie chimique en énergie mécanique par les kinésines permet aux eucaryotes de modifier l'organisation de leur contenu cellulaire. Pour ce, les rôles des kinésines et des microtubules sont étroitement liés puisque ces derniers sont les 'rails' sur lesquels les kinésines se déplacent. L'activité biochimique des kinésines est bien caractérisée et leur repliement est connu. Par contre, l'interaction de ces protéines avec les microtubules et les changements de cette interaction qui leur permettent d'utiliser l'énergie issue de l'hydrolyse de l'ATP restent largement incompris. Notre objectif est de déterminer la structure de complexes de la tubuline avec des kinésines, de façon à définir à l'échelle atomique les mécanismes de fonctionnement de ces protéines. Ceci devrait apporter des informations sur les deux processus cellulaires fondamentaux, le traffic cellulaire dépendant des microtubules et la dépolymérisation du cytosquelette microtubulaire. L'obstacle majeur est l'obtention d'un complexe kinésine-tubuline homogène et monodisperse qui permette d'entreprendre des essais de cristallisation dans de bonnes conditions. La plupart des kinésines ont une forte affinité pour les microtubules mais une très faible affinité pour la tubuline soluble ; leurs complexes avec la tubuline ne se prêtent donc pas à une analyse structurale à haute résolution. Nous mettrons à profit la forte affinité entre la tubuline soluble et les kinésines dont le domaine moteur est en position interne de la séquence pour isoler un complexe tubuline kinésine qui se prête à une analyse radiocristallographique. La caractérisation par radiocristallographie de ces complexes nécessitera deux développements : - la production de fragments monomériques de kinésines à domaine moteur interne solubles, fonctionnels et ayant une forte affinité pour la tubuline ; - la formation de complexes monodisperses, en évitant en particulier la propension de la tubuline à former des agrégats hélicoïdaux et des anneaux de tailles variables. Pour ce qui concerne le premier aspect, nous utiliserons des approches classiques de génétique moléculaire, appliquées aux kinésines à domaine moteur interne identifiées chez l'homme, la souris et chez Plasmodium falciparum. Pour ce qui concerne le deuxième aspect, nous testerons l'utilité de deux types de complexes qui empêchent l'agrégation de la tubuline : - les complexes avec des domaines de type stathmine ou leurs fragments qui suffisent à séquestrer la tubuline - les complexes avec des dérivés de la vinblastine conçus de façon à empêcher la fixation de l'un des deux hétérodimères de tubuline qui se fixent normalement à cette petite molécule. La structure de la tubuline soluble étant connue ainsi que le repliement des kinésines, nous utiliserons, dans un premier temps, le remplacement moléculaire pour déterminer la structure du complexe.